千年健的化学成分及抗肿瘤活性研究

尹 伟，胡 琪，李新章，周清浩，郁 阳，胥振国，范高福，张国升

1合肥职业技术学院 生物工程学院，合肥 238000；2南通睿沣新材料技术有限公司 化学成分分离鉴定中心，南通 226000；3中国科学技术大学高分子科学与工程系 中科院软物质化学重点实验室，合肥 230026；4中国科学院昆明植物研究所 植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，昆明 650201；5安徽中医药大学 药学院，合肥 230031

千年健(Homalomenaocculta(Lour.)Schott.)作为天南星科千年健属植物，本属植物约有140余种，主要分布于亚洲及美洲等地区，在我国的云南、海南、广西、广东等地为主要分布区域[1]。千年健于2000年收录入《中国药典》，主要用于风寒，风湿等疾病的治疗。《本草纲目拾遗》中记载：“形如藤，长数尺，气极香烈”。千年健传统上主要以其干燥的根茎作为药用，同时为少数民族习用，在针对痉挛麻木、风湿、类风湿关节炎、腰腿疼痛、胃肠功能炎症以及骨折等方面具有很好的治疗作用[2]。有研究报道[3]，该植物含有倍半萜、生物碱、酚酸以及挥发油等成分，具有很强的抗氧化、杀线虫、细胞毒性以及抑菌活性，同时具有一定程度的抗炎作用[4]。亦有研究表明[5]，千年健中所含的倍半萜成分，能促进骨细胞增殖分化，间接抑制炎症因子一氧化氮、前列腺素E2以及环氧化酶2的释放，具有潜在的抗骨质疏松作用。本文在前期研究的基础上，进一步对千年健的化学成分进行分析，旨在发现具有抗肿瘤生理活性的化学成分，为完善天南星科植物的药用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

质谱仪(VG Auto-Spec-3000，Micromass公司)；核磁共振仪(Bruker DRX-500 MHz)；Büchi B-688型高效液相制备色谱仪(Büchi公司，瑞士)；旋转蒸发仪(RE-201，上海科兴仪器有限公司)；酶标仪(BXS01-ELx-800，美国)。

1.2 药材与试剂

千年健(Homalomenaocculta(Lour.)Schott.)由南通睿沣新材料技术有限公司提供(No.rfzy20201008)，由李新章、胡琪研究员鉴定为千年健。宫颈癌细胞(Hela)、人肺癌细胞(A549)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)及人肝癌细胞(HepG2)(中国科学技术大学生科院)。肝癌细胞小鼠(H22、BALB/c)，清洁级，4～5周(中国科学技术大学生科院)；RPMI-1640培养基(北京君立康生物科技有限公司)；乙酸乙酯、甲醇、乙醇、三氯甲烷(成都金山化学试剂有限公司)；MTT(四甲基偶氮唑盐，上海拜力生物技术有限公司)；甲氨蝶呤(河北阿尔泰生物科技有限公司)；DMSO(二甲基亚砜，Sigma公司)；Sephadex LH-20(50 μm，GE公司)；硅胶和薄层色谱硅胶(青岛海洋化工公司)；显色剂为碘蒸气或10%硫酸-乙醇溶液(105 ℃加热显色)或在紫外灯254 nm及365 nm处观察荧光。

1.3 提取与分离

称取8.0 kg干燥千年健，粉碎后，室温下用95%的乙醇浸提3次(每次36 h)，用旋转蒸发仪将溶剂减压浓缩，最终得到浸膏约260 g。将浸膏中加入适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇有机溶剂进行充分萃取。随后，浓缩乙酸乙酯萃取部分，得到浸膏约120 g。

乙酸乙酯部分通过正相硅胶色谱分离(200～300目)，三氯甲烷-甲醇洗脱系统(100∶0、100∶5、100∶10、100∶20、100∶50、100∶100，V/V)梯度顺序洗脱，经过薄层色谱(TLC)检测合并，最终得到6个部分(Fr.1～6)。Fr.1(29.7 g)经反复硅胶柱洗脱、纯化，最终使用Sephadex-LH20凝胶柱(三氯甲烷∶甲醇 = 1∶1，V/V)纯化，得到化合物1(22.3 mg)。Fr.2(22.7 g)通过反复硅胶柱分离，分别石油醚-丙酮洗脱(10∶1→0∶1，V/V)，MPLC(中压制备，30%～100%乙腈，流速为1 mL/min)，随后经过Sephadex-LH20(纯甲醇)凝胶柱纯化，得到化合物8(10.2 mg)、2(22.7 mg)、4(24.8 mg)、5(11.9 mg)。Fr.3(30.5 g)通过硅胶柱色谱分离，分别石油醚-乙酸乙酯洗脱(10∶1→0∶1，V/V)，经Sephadex-LH20(三氯甲烷∶甲醇 = 1∶1，V/V)凝胶柱洗脱，丙酮重结晶得到化合物10(10.3 mg)、3(11.9 mg)。Fr.4(28.6 g)通过硅胶柱纯化，石油醚-三氯甲烷-甲醇(5∶4∶1，V/V)洗脱，通过制备薄层色谱，三氯甲烷-丙酮(3∶2，V/V)得化合物7(25.1 mg)；经Sephadex-LH20凝胶柱(三氯甲烷∶甲醇 = 1∶1，V/V)洗脱纯化，得到化合物9(12.4 mg)；经三氯甲烷-丙酮(3∶1，V/V)，丙酮重结晶得化合物6(16.2 mg)。

1.4 细胞毒性试验

称取一定量化合物1～10，将其用DMSO溶解(二甲亚砜，浓度<3‰培养液体积分数)，随后超声30 min，放冰箱冷藏，备用。体外抗肿瘤活性试验，采取MTT法进行[6]。将对数生长期的各种肿瘤细胞(HepG2、A549、4T1及Hela)，稀释成单细胞混悬液，以约1×104个/mL，接种于96孔培养板上，每孔100 μL，放置培养箱中(37 ℃，5%的CO2)，培养24 h后，除去培养液，加入不同浓度的待测化合物，继续培养48 h。在测试前，在接种板的每孔加入MTT(5 mg/mL，30 μL)，继续孵育3 h。使用酶联免疫检测仪，测定各个化合物吸光度(A，490 nm波长)。其中，细胞抑制率=(1-OD试验组/OD对照组)×100%，分别计算得出每个化合物对各肿瘤细胞增殖抑制数值，其中，阳性对照药物为甲氨蝶呤，最终得出IC50值(50%的肿瘤细胞增殖抑制数值对应的每个化合物的具体浓度)。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1白色粉末；ESI-MS：m/z479[M+Na]+，C30H48O3；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：3.09(1H，dd，J= 11.3，5.0 Hz，H-3)，3.02(1H，dt，J=10.9，4.8 Hz，H-19)，4.58(1H，br s，H-20)，0.92(3H，s，H-23)，0.70(3H，s，H-24)，0.80(3H，s，H-25)，0.90(3H，s，H-26)，0.90(3H，s，H-27)，4.69(1H，br s，H-29a)，4.47(1H，br s，H-29b)，1.60(3H，s，H-30)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：38.7(C-1)，C-2(27.1)，76.5(C-3)，38.5(C-4)，54.6(C-5)，18.2(C-6)，34.0(C-7)，40.4(C-8)，50.1(C-9)，37.0(C-10)，20.7(C-11)，25.3(C-12)，37.8(C-13)，42.2(C-14)，30.4(C-15)，31.9(C-16)，55.5(C-17)，46.8(C-18)，48.9(C-19)，150.4(C-20)，29.1(C-21)，36.8(C-22)，28.4(C-23)，15.7(C-24)，16.1(C-25)，15.9(C-26)，14.5(C-27)，177.6(C-28)，19.1(C-29)，109.9(C-30)。以上数据与文献[7]报道基本一致，故鉴定化合物1为桦木酸。

化合物2白色粉末；ESI-MS：m/z521[M + Na]+，C32H50O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.30(s，1H，H-12)，4.53(s，1H，H-3a)，2.86(dd，J= 13.4，3.5 Hz，1H，H-18b)，2.10(s，3H，OAc)，1.29(s，3H，Me)，1.17(s，3H，Me)，0.99(d，J= 8.8 Hz，6H，2×Me)，0.93(s，3H，Me)，0.91(s，3H，Me)，0.78(s，3H，Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：38.2(C-1)，23.6(C-2)，80.8(C-3)，37.8(C-4)，55.3(C-5)，18.3(C-6)，32.7(C-7)，39.3(C-8)，47.4(C-9)，37.0(C-10)，22.7(C-11)，122.4(C-12)，143.7(C-13)，41.3(C-14)，40.7(C-15)，23.4(C-16)，45.9(C-17)，46.7(C-19)，30.8(C-20)，33.8(C-21)，32.5(C-22)，28.2(C-23)，16.8(C-24)，15.5(C-25)，17.3(C-26)，25.8(C-27)，27.6(C-15)，184.5(C-28)，23.7(C-29)，33.2(C-30)，21.5(CH3CO)，171.1(C=O)。以上数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定该化合物2为 3β-acetoxyolean-12-en-28-oic acid。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z479[M+Na]+，C30H48O3；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.17(1H，t，J= 3.4 Hz，H-12)，2.99(1H，dd，J= 5.1 Hz，H-3)，1.10(3H，s，H-27)，0.94(3H，s，H-23)，0.97(3H，d，J= 6.8 Hz，H-29)，0.90(3H，s，H-26)，0.83(3H，d，J= 6.7 Hz，H-30)，0.78(3H，s，H-24)，0.71(3H，s，H-25)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：38.1(C-1)，22.6(C-2)，76.9(C-3)，38.6(C-4)，52.6(C-5)，17.2(C-6)，36.4(C-7)，38.8(C-8)，47.3(C-9)，38.0(C-10)，23.4(C-11，C-23)，124.8(C-12)，138.7(C-13)，41.8(C-14)，32.8(C-15)，21.4(C-16)，47.0(C-17)，54.7(C-18)，30.1(C-19)，28.5(C-20)，27.6(C-21)，36.2(C-22)，16.7(C-24)，16.4(C-25)，15.3(C-26)，27.1(C-27)，178.6(C-28)，18.3(C-29)，23.9(C-30)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定化合物3为熊果酸。

化合物4白色固体粉末；ESI-MS：m/z341[M + Na]+，C20H30O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.24(dd，J= 12.1，2.5 Hz，1H，H-20)，4.21(d，J= 12.1 Hz，1H，H-20)，2.20～0.81(m，27H，Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：19.8(C-2)，36.8(C-3)，37.5(C-4)，50.2(C-5)，21.5(C-6)，38.7(C-7)，43.8(C-8)，49.3(C-9)，42.1(C-10)，16.6(C-11)，24.8(C-12)，47.2(C-13)，39.7(C-14)，56.8(C-15)，78.1(C-16)，23.5(C-17)，22.2(C-18)，175.7(C-19)，73.0(C-20)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定该化合物4为antriptolactone。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z415[M-H]-，C21H20O9；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.60(1H，s，OH)，8.00(1H，d，J= 9.8 Hz，H-4)，6.98(1H，s，H-5)，6.79(2H，s，H-2′，6′)，6.42(1H，d，J= 9.8 Hz，H-3)，4.99(1H，d，J= 8.2 Hz，H-7′)，4.41(1H，m，H-8′)，3.86(3H，s，OMe)，3.91(6H，s，2×OMe)，3.76(1H，s，H-9′a)，3.41(1H，m，H-9′b)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：160.2(C-2)，113.6(C-3)，145.8(C-4)，101.2(C-5)，145.6(C-6)，137.8(C-7)，131.3(C-8)，138.2(C-9)，111.8(C-10)，125.3(C-1′)，105.7(C-2′，6′)，148.2(C-3′，5′)，136.7(C-4′)，76.9(C-7′)，77.5(C-8′)，60.2(C-9′)，56.7(3′，5′-OMe)，56.1(6-OMe)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物5为黄花菜木脂素C。

化合物6无色针晶；ESI-MS：m/z257.1[M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：4.21(1H，d，J= 4.5 Hz，OH)，4.00(1H，s，OH)，3.71(1H，s，OH)，3.21(1H，ddd，J= 11.5，4.5，4.5 Hz，H-1)，1.92(1H，d，J= 13.6 Hz，H-5)，1.17(3H，s，H-15)，1.13(3H，s，H-12)，1.12(3H，s，H-13)，0.91(3H，s，H-14)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：78.9(C-1)，40.6(C-2)，41.8(C-3)，70.5(C-4)，59.6(C-5)，32.2(C-6)，51.9(C-7)，32.6(C-8)，28.6(C-9)，47.3(C-10)，70.8(C-11)，31.9(C-12)，30.8(C-13)，15.3(C-14)，30.7(C-15)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定化合物6为bullatantriol。

化合物7白色无定形粉末；ESI-MS：m/z257.1[M+ H]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：4.38(1H，dd，J=11.3，4.3Hz，H-6)，3.29(1H，dd，J=9.9，4.4 Hz，H-1)，1.80(1H，d，J=11.2 Hz，H-5)，1.32(3H，s，H-15)，1.17(3H，d，J=6.9 Hz，H-12)，0.97(3H，d，J=6.8 Hz，H-13)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：78.9(C-1)，28.6(C-2)，36.1(C-3)，73.0(C-4)，50.9(C-5)，72.3(C-6)，47.5(C-7)，22.7(C-8)，36.1(C-9)，40.9(C-10)，25.4(C-11)，21.7(C-12)，24.1(C-13)，13.8(C-14)，23.8(C-15)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物7为菠萝香藤素。

化合物8白色无定形粉末；ESI-MS：m/z257.2[M+H]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：3.90(1H，dd，J= 12.9，9.7 Hz，H-6)，3.15(1H，dd，J= 11.5，4.6 Hz，H-1)，1.10(1H，d，J= 9.5 Hz，H-5)，1.47(3H，s，H-15)，1.08(3H，s，H-14)，0.91(3H，d，J= 6.6 Hz，H-12)，0.86(3H，d，J= 6.9 Hz，H-13)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：78.6(C-1)，27.3(C-2)，41.7(C-3)，71.3(C-4)，57.0(C-5)，68.7(C-6)，52.0(C-7)，18.6(C-8)，38.0(C-9)，41.0(C-10)，25.9(C-11)，20.8(C-12)，15.7(C-13)，12.2(C-14)，34.0(C-15)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物8为mucrolidin。

化合物9黄色粉末；ESI-MS：m/z257[M+H]+，C15H14O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.13(1H，s，5-OH)，10.87(1H，s，7-OH)，7.33～7.57(5H，m，Ph)，5.95(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，5.61(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，5.53(1H，dd，J= 12.3，2.5 Hz，H-2)，3.21(1H，dd，J= 17.2，12.4 Hz，H-3a)，2.73(1H，dd，J= 17.2，3.7 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.4(C-2)，43.6(C-3)，193.2(C-4)，163.8(C-5)，95.0(C-6)，167.1(C-7)，96.3(C-8)，162.6(C-9)，100.3(C-10)，138.1(C-1′)，127.8(C-2′，6′)，129.1(C-3′，5′)，127.6(C-4′)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定该化合物9为 pinocembrin。

化合物10黄色固体粉末；ESI-MS：m/z177[M-H]-，C10H10O3；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：9.57(1H，t，J= 6.7 Hz，H-3)，7.33～7.37(1H，m，H-2′)，7.11(1H，dd，J= 8.1，1.7 Hz，H-6′)，7.07(1H，d，J= 1.5 Hz，H-5′)，6.85(1H，dd，J= 11.4，7.6 Hz，H-1)，6.50(1H，dd，J= 15.3，7.9 Hz，H-2)，3.84(3H，d，J= 4.4 Hz，OMe)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：126.2(C-1)，126.7(C-2)，194.3(C-3)，55.8(-OMe)，147.4(C-1′)，109.9(C-2′)，153.6(C-3′)，149.5(C-4′)，115.2(C-5′)，124.3(C-6′)。以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定该化合物10为 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propenal。

2.2 体外抗肿瘤活性试验

2.2.1 细胞毒性试验

采用SPSS 22.0软件，数据分析采用t检验，检验水准α= 0.05，以P< 0.05表示差异符合统计学概念。对各化合物进行体外抗肿瘤活性筛选，通过抗肿瘤药物甲氨蝶呤作为阳性对照，研究各化合物对肿瘤细胞的细胞毒活性。细胞毒活性试验结果显示，化合物2、4、9对四株肿瘤细胞(Hela、HepG2、4T1、A549)的增殖具有相应的抑制作用，能够在一定程度抑制上述四种肿瘤细胞的生长。化合物2、4、9的细胞毒活性数据见表1。

表1 化合物2、4、9的细胞毒活性

2.2.2 化合物的细胞毒性(活细胞/死细胞分析)

为了直观的分析化合物2、4、9的细胞毒性，本研究选取4T1肿瘤细胞，具体实验步骤，参考了文献[17]。分析各化合物对4T1的细胞毒性。直接观察化合物处理后的细胞状态(经AM/PI染色处理后的各种图像)，其中活细胞(绿色)、死细胞(红色)，与不同剂量抗肿瘤药物甲氨蝶呤(2 μg/mL，20 μg/mL)对比，化合物2、4、9也具有良好的抗癌能力，与上述细胞毒性的试验(MTT法)结论一致。结果如图1所示。

图1 化合物2、4、9及甲氨蝶呤药物对4T1细胞处理后状态

2.2.3 细胞毒性机理试验

通过上述“2.2.2”的各化合物对肿瘤细胞的毒性试验，发现化合物2、4、9对各肿瘤细胞有较强的损伤，为了具体评估各化合物对肿瘤细胞的损伤情况，本研究进行了单细胞凝胶电泳实验，即“彗星”试验。选取4T1肿瘤细胞，使用不同剂量抗肿瘤药物甲氨蝶呤(2 μg/mL，20 μg/mL)作为对照，分析其细胞DNA的损伤情况。试验步骤参照文献[18]进行，结果如图2所示。

图2 单细胞凝胶电泳实验

2.3 化合物体内抑瘤试验

通过4T1荷瘤小鼠，观察化合物2、4、9的抑瘤效果，参照文献方法[19,20]，得到小鼠肿瘤的指标生长曲线。将4T1荷瘤小鼠随机分成5组(PBS组、化合物2组、化合物4组、化合物9组、甲氨蝶呤组)，在随后的第0、3、6、9天，对小鼠腹腔注射待测化合物2、4、9及抗肿瘤药物甲氨蝶呤(阳性对照组)，药物浓度均为10 mg/kg(按小鼠体重计)，其中，PBS组(生理盐水)为对照组。给药后的21天，将小鼠处死，记录小鼠的肿瘤的生长状态(体积、重量等)。结果如图3所示。

图3 荷瘤小鼠的抑瘤试验

3 结论

本文主要研究了千年健的化学成分及抗肿瘤作用，应用中压制备液相、Sephadex LH-20等分离手段，从千年健醇提溶液中分离得到10个化合物。除化合物7、8外，本实验所分离得到的其余化合物，均为首次从千年健植物中分离。

研究发现了化合物2、4、9对4T1、A549、Hela及HepG2肿瘤细胞有很强的毒性。在对4T1荷瘤小鼠的体内试验时，化合物2、4、9组对荷瘤小鼠小的肿瘤生长指标(肿瘤体积、重量等)方面，与甲氨蝶呤的治疗对比，有较强的效果。

本文在前期研究的基础上，针对千年健的化学成分、体内、外的抗肿瘤作用等多方面进行研究，旨在发现千年健中具有抗肿瘤生理活性的化学成分，从而进一步完善天南星科植物的药用价值。