负载骨髓干细胞来源外泌体的3D 水凝胶通过调节免疫促进损伤软骨的修复

由于缺乏血管、神经和淋巴组织，关节软骨自我修复的能力受到限制。一旦受损，就会导致关节肿胀和疼痛，加速骨关节炎的进展。迄今为止，尽管目前已取得很多进展，但是完全再生透明软骨以及恢复其原有的机械特性仍然是一个难以实现的目标。免疫反应越来越被认为是影响软骨修复的关键因素。相关研究表明巨噬细胞在生长板损伤后的炎症期中占主导作用。巨噬细胞主要包括炎性巨噬细胞M1型和修复型巨噬细胞M2型。软骨在损伤后巨噬细胞被激活成M1型浸润到损伤局部，并分泌大量促炎症因子（如TNF-α、IL-1β等），这些炎症因子可持续存在，加速了软骨基质的降解。此外，在炎症微环境中，间充质干细胞发生异常分化，软骨细胞开始转化或去分化为成纤维样细胞，形成机械性能差的纤维软骨。在修复期，M2巨噬细胞可分泌抗炎因子和软骨细胞因子，从而抑制炎症反应，促进软骨修复。因此，软骨再生需要对关节炎症微环境进行多维时空调节，在炎症阶段促进巨噬细胞由M1型向M2型转化，将有利于软骨再生。

间充质干细胞（MSCs）已被证明具有免疫调节特性和对组织具有修复作用通过调节免疫微环境。并且研究表明MSCs的抗炎作用是由于其旁分泌机制，主要涉及外泌体的分泌。外泌体是直径30～200 nm的由细胞分泌的囊泡，功能类似于亲代间充质干细胞。此外，外泌体相对与细胞来说较容易储存和运输，可以避免细胞移植的许多限制，包括免疫原性和致瘤性。外泌体携带各种蛋白质、脂质和各种非编码RNA，特别是miRNA，它们通过调控受体细胞的活性发挥免疫调节作用。然而，单纯的外泌体治疗在体内的治疗效果有限，主要由于外泌体局部浓度以及一过性的释放而无法保证持续的作用。因此，亟需开发一种模拟细胞外基质（ECM）的3D支架充当有效的载体。甲基丙烯酸改性的明胶（GelMA）在某些性质上与天然ECM相似，具有良好的生物相容性和可调节的物理性质，在众多组织工程领域中有广泛的应用，包括骨骼、软骨和心脏组织工程等。以GelMA为基材的水凝胶可以作为外泌体的理想载体在神经损伤、小儿生长板损伤等领域已得到证实，而在软骨损伤中却很少有报道。本研究中，我们旨在体外将甲基丙烯酸改性的明胶水凝胶（GelMA）与骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的外泌体结合，通过抑制炎症以及调节巨噬细胞由M1型向M2型转化，从而促进软骨损伤的修复。我们评估了负载外泌体水凝胶的理化性质、细胞生物相容性以及对于巨噬细胞的影响通过体外共培养系统研究了通过调节巨噬细胞向M2型极化对于损伤软骨细胞的作用，并且通过大鼠软骨损伤模型评估了负载外泌体的水凝胶对软骨损伤修复的作用。

作为国家各级各类教育机构与组织的体系及其管理规则，教育制度呈现出“义务教育年限的延长、普通教育与职业教育的综合化、高等教育的大众化、终身教育体系的建构”[7]等改革趋势。“深化教育改革”是习近平新时代中国特色社会主义教育制度论的核心关键词[8]。十八届三中全会提出要“深化教育领域综合改革”，将综合改革作为当前我国教育改革与发展的重要任务。“十三五”规划首次明确将“提高教育质量”作为未来5年教育工作的重点任务。习近平对深化教育改革提出了明确要求 [9]，贯穿了从基础教育到职业教育到高等教育等整个阶段，涵盖了从家庭教育到学校教育到社会教育等全部领域。

1 材料和方法

1.1 软骨细胞和RAW264.7细胞的获取

软骨细胞是从2周龄SD大鼠的膝关节软骨组织中按既定方法获得。SD大鼠从南方医科大学实验动物中心购买。收集的软骨细胞在加入10%FBS（Gibco）、100 U/mL青霉素和100U/mL链霉素（Gibco）的Dulbecco 改良Eagle 培养基（DMEM）/F-12 培养基（Gibco）中在5%CO、37 ℃条件下培养。培养基每隔1 d 更换1 次，我们使用第2 代到第4 代的细胞。RAW264.7细胞取自ATCC细胞库并在含有10%胎牛血清的DMEM培养基于5%CO、37 ℃恒温培养箱中培养。

1.2 骨髓间充质干细胞的提取和鉴定

根据之前研究，通过冲洗2周大鼠胫骨和股骨的骨髓腔获得骨髓间充质干细胞。提取的骨髓间充质干细胞放在含10%血清的低糖DMEM（Gibco）培养基中，并在37 ℃，5%CO的细胞培养箱中孵育。3～5代（P3-P5）的细胞用于后续的实验。分别使用成骨和成脂分化培养基对骨髓干细胞进行培养后，使用茜素红染色、油红O染色验证骨髓间充质干细胞的多细胞系分化潜力。

将获取的骨髓间充质干细胞在添加10%无外泌体血清的低糖DMEM（Gibco）中培养。在细胞融合达到50%～60%后，收集上清液进行超速离心。首先，将上清液以300、3000、10 000离心10 min，以分离活/死细胞和细胞碎片。然后，在100 000离心90 min后，在离心管底部的外泌体用磷酸盐缓冲盐水（PBS）重悬并储存在-80 ℃。以上所有离心过程均在4 ℃下进行。

1.3 骨髓间充质干细胞来源的外泌体的分离、鉴定以及染色

2.2比较两组患儿外漏、低血糖、皮下沉积等并发症发生情况,具体情况(见表2),实验组共有3例患儿发生并发症,对照组共有7例患儿发生并发症,实验组患儿并发症发生率均明显低于对照组。

收集到的外泌体通过表面标记抗体进行鉴定，包括CD9（ProteinTech）和TSG101（Abcam）。分别使用透射电子显微镜（TEM）和纳米粒子跟踪分析（qNanosystem,Izon Science）观察形态和尺寸分布。根据说明书使用红色荧光染料PKH26（Sigma-Aldrich）进行外泌体染色。

通过甲基丙烯酸改性明胶前后的H核磁共振谱图，发现MA改性明胶（GelMA）在5.3 ppm 和5.5 ppm 新出现了两个属于甲基丙烯酰胺（MA）的质子峰（图2A）。流变性能测试表明，GelMA-Exo 的储能模量（G’）远大于损耗模量（G”），并且它的储存模量为1525±50 Pa（图2B）。SEM成像结果显示水凝胶呈多孔网络结构，且外泌体结合在GelMA水凝胶内表面（图2C）。外泌体的释放持续了14 d，超过80%的外泌体从水凝胶中释放（图2D～E）。

1.4 外泌体-水凝胶体系的构建

在50 ℃下将称取的5 g明胶（Gel，Sigma-Aldrich）加入到50 mL PBS溶液中，进行搅拌直至明胶完全溶解。然后量取4 mL 的甲基丙烯酸酐（MA，Sigma-Aldrich）以0.5 mL/min的速度缓慢滴加到明胶溶液中，在以上条件下磁力搅拌连续反应3 h后终止反应。随后将溶液置入透析袋（12 000～14 000）中，在50 ℃下的纯水中进行透析6 d。将透析后的溶液在2000 r/min下进行离心10 min，取上层清液，在冷冻干燥机中进行冻干6 d，最终得到泡沫状的甲基丙烯酸改性明胶样品（GelMA）。将GelMA在50 ℃下溶解在重水（DO）中，采用核磁共振谱仪进行验征是否改性成功。将冻干的GelMA 溶解于浓度为0.5%()的光引发剂Irgacure 2959（Sigma-Aldrich）溶液中，制备成浓度为10%()的单体预聚溶液。将200 μg外泌体与60 μL水凝胶溶液充分混合，在紫外辐射（6.9 mW/cm2，360～480 nm）下聚合15 s以获得外泌体-水凝胶体系（GelMA-Exo）。

1.5 材料表征

研究揭示了在不同的企业生命周期阶段，碳信息披露对企业融资约束的影响存在差异化。启示企业在努力构建全面规范的碳信息披露体系的同时，应结合企业所处的生命周期，做好企业碳信息披露的战略规划安排，以实现企业价值在不同生命周期阶段的最大化。

1.6 外泌体释放曲线的测定

根据之前的研究，使用双茚二酮酸(BCA)试剂盒（Beyotime）评估累积释放和每日释放情况。将上述制备的GelMA-Exo 在37 ℃条件下在PBS 溶液中孵育。在第1、3、7、14天收集上清，使用BCA法进行游离外泌体的检测，外泌体总量减去上清液中游离外泌体的量就是水凝胶负载的外泌体的总量。

铝合金的纳标重点是：高纯铝合金材料及其相应成套的测试标准。高纯铝合金材料对铝合金的成分控制的非常严格，使得合金的疲劳度、断裂性能以及抗腐蚀性能都有明显提高，因此它是飞机采用损伤容限设计及可靠性设计的理想化材料，也是航空铝合金的主要发展方向。铝合金的预拉伸板、锻件规范、挤压管材等国家军用标准的制定，为飞机重要主承力结构零件的制造提供了原材料的保障，进而满足了飞机批量生产的需要。目前我国飞机发动机制造过程中直接使用GJB的铝合金标准，铝合金的棒、线、管材使用GB。而对于镁合金的GB，实际运用在制造、生产钢棒与铸造合金中。

1.7 外泌体的摄取

为证实水凝胶中含有的外泌体可被细胞吞噬，将RAW264.7细胞与GelMA-Exo共培养24 h。24 h后，吸取出培养基，PBS洗涤3次，然后用4%多聚甲醛固定20 min。激光共聚焦显微镜（Leica）下免疫荧光（IF）染色观察外泌体的吞噬情况（细胞骨架用Actin-Tracker Green 染色（Beyotime），细胞核用Hoechst 33342染色（Beyotime））。

1.8 材料生物相容性评价

进行体外生物相容性实验，包括细胞活力、增殖和粘附实验。为了进行活/死染色试验，将密度为1×10的软骨细胞种植在12孔培养板上，与各组材料共培养24 h，然后以1 mL∶3 μL∶5 μL（PBS:calcein-AM（Invitrogen）∶PI（Invitrogen））的比例制备活/死液，每组加入，并且在37 ℃下孵育30 min后激光显微镜观察。将1×10软骨细胞分别与各组软骨细胞共培养1、3、7 d后，分别加入100 μl/mL 的CCK-8溶液（Beyotime）培养2 h。然后在96孔板上加入100 μL 上清液，用酶标仪（BioTech）测定吸光度。最后用以下方法检测细胞与水凝胶的粘附性：简单地说，密度为1×10/孔的细胞培养3 d，用4%的多聚甲醛固定，用Actin-Tracker Green和Hoechst 染色，并用共聚焦显微镜观察细胞的形态。

1.9 GelMA-Exo/RAW264.7细胞/软骨细胞共培养体系的建立

为了检测系统免疫微环境对软骨细胞的影响，用Transwell室（ThermoFisher）建立了GelMA-Exo/RAW264.7细胞/软骨细胞共培养体系。实验前用IL-1β（10 ng/mL）处理软骨细胞24 h。GelMA-Exo与1×10RAW264.7细胞共培养，置于下室，1×10软骨细胞置于上室。1.0 μm孔径的聚碳酸酯膜将两层膜隔开，不影响细胞因子的自由通过。

在经济发展的新形势下，涉农企业面临的内外部环境发生着改变，这就要求企业能够适时调整并优化完善公司治理结构，在加强党的领导下提高涉农企业公司治理的自主创新能力，提升治理效率，从而实现涉农企业稳定发展，助推我国农业现代化实现、农村繁荣和农民增产增收。

1.10 基因表达测定

GelMA组与对照组各项指标相比差异没有统计学意义（＞0.05，图5A）。GelMA-Exo组和Exo组显著上调软骨细胞的COL-2和SOX-9水平，下调MMP-13的表达（＜0.05,图5A）。q-PCR结果还显示GelMA-Exo组在第7天的治疗效果明显优于Exo组（＜0.05，图5A）。免疫荧光染色分析与q-PCR结果一致，GelMA-Exo组COL-2蛋白表达最高，而MMP-13蛋白表达最低（＜0.05，图5B～C）。

利用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM,ZEISS）观察了水凝胶的内部形貌和结构。用安东帕MCR 301流变仪在恒定应变（5%）对水凝胶进行频率扫描，扫描频率为0.1～10 Hz，以检测水凝胶材料的储能模量（G’）和损耗模量（G”）。

1.11 Western blotting检测

细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher）的RIPA缓冲液（CWBIO）中研磨成匀浆。上清液在冰上裂解30 min，在4 ℃下12 000 r/min离心30 min收集。用BCA试剂盒（Beyotime）测定总蛋白浓度。将等量（40 μg）的蛋白上载于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上。将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF,Thermo Fisher）膜上，用5%脱脂乳封闭PVDF膜1 h，然后用一抗孵育过夜（表2）。然后将PVDF膜与二抗孵育1 h，然后应用增强化学发光（ECL）试剂盒（Thermo Fisher）进行。在每一步之前，使用TBST缓冲盐水清洗膜3次。使用ImageJ软件进行分析。

1.12 免疫荧光检测

实验数据用均数标准差表示。采用GraphPad Prism 5软件进行Tukey 检验的单因素方差分析。所有实验至少重复3次。＜0.05为差异具有统计学意义。

1.13 大鼠膝关节软骨损伤模型的构建

12 只8 周龄雌性SD 大鼠分为4 组，即假手术组（Sham）、单纯损伤组（SI）、GelMA 组和GelMA-Exo组。首先，分别使用腹腔注射吡嗪（6 mg/kg）和氯胺酮（70 mg/kg）进行麻醉后，左腿刮毛，用碘伏彻底消毒。在无菌条件下切开内侧髌骨皮肤和肌肉暴露股骨髁。随后，使用15 g针沿股骨纵轴钻一个直径2 mm的孔，使其损伤表面软骨。每只老鼠经处理后，缝合切口并再次消毒。然后把老鼠关在单独的笼子里，让它们自由地获得食物和水。术后4周对所有大鼠实施安乐死。

1.14 组织学评价

治疗4周后处死大鼠，采集关节软骨标本。组织用多聚甲醛固定24 h，在10%EDTA（pH 7.4）中脱钙21 d后，进行石蜡包埋、切片。切片在二甲苯中脱蜡，通过一系列分级的乙醇洗涤再水化后，使用苏木精和伊红（H&E）以及Masson染色评估软骨修复情况。

1.15 统计学分析

首先样品用4%多聚甲醛在PBS 中固定30 min。然后，用0.2%Triton X-100（Biofroxx）处理细胞或组织10 min，在室温下用3%牛血清白蛋白（BSA，Biofroxx）封闭1 h，最后加入一抗在4 ℃条件下过夜。此后，样品用PBS 洗涤3次，室温下与二抗孵2 h，并进行Hoechst（Beyotime）染色。最后，在共聚焦显微镜下观察染色情况。相关抗体列在表2中。

2 结果

2.1 骨髓干细胞及其外泌体表征

在光学显微镜下，骨髓间充质干细胞表现为典型的纺锤体形态（图1A）。用茜素红、油红染色表明提取的骨髓间充质干细胞具有多细胞系分化潜力（图1B）。通过透射电镜观察，其形态为圆形或椭圆形，细胞膜结构完整（图1C）。粒径分析表明直径主要集中在89 nm 左右，与外泌体的粒径分布一致（图1D）。蛋白免疫印迹结果分析表明，纳米粒子表达了外泌体特异性标记CD9和TSG101（图1E）。

2.2 材料的合成与表征

β2-MG是由淋巴细胞或者其他有核细胞分泌一种内源性低分子量血清蛋白质。血清中的99.9%的β2-MG会被近曲小管细胞重吸收和降解，不再向血液中反流，以此保持β2-MG在体内的恒定。但当近曲小管轻度受损时，尿液中β2-MG会显著增加[7]，可见人体肾脏的损伤程度与β2-MG具有明显的对应关系。

2.3 生物相容性评估

活/死染色显示各组均可见大量活细胞（绿色），少量死细胞（红色）（图3A）。CCK-8分析结果表明，软骨细胞增殖随着培养时间的延长而增加。在第3天和第7天，GelMA-Exo和Exo组软骨细胞活性显著高于对照组和GelMA组（＜0.05，图3B）。细胞骨架成像显示，各组的软骨细胞都具有较大的扩张面积（图2C）。

2.4 GelMA-Exo促进RAW264.7细胞由M1型向M2型转化

装载在GelMA 水凝胶上的外泌体能够被RAW264.7细胞吞噬并发挥免疫调节作用（图4A）。第3天，q-PCR结果显示，M2表型标记（Arg-1和IL-10）在GelMA-Exo组和Exo组的表达值显著高于对照组（＜0.05，图4B）。而GelMA组与对照组差异无统计学意义（＞0.05，图4B）。在第7天时，q-PCR结果显示GelMAExo显著提高了Arg-1和IL-10的表达水平，而iNOS和TNF-α的表达水平降低（＜0.05，图4B）。与q-PCR分析一致，第7天免疫荧光结果显示与对照组相比，GelMAExo组iNOS阳性细胞比例较低，而Arg-1阳性细胞比例较高（＜0.05，图4C～D）。

2.5 GelMA-Exo通过改善免疫微环境促进IL-1β损伤的软骨细胞的修复

首先使用一种RNA提取试剂盒提取细胞总RNA（Omega），然后使用EVO MLV RT试剂盒将其（Accurate Biotechnology）逆转录成cDNA。采用LightCycler 480 SYBR Green Master Mix（TaKaRa）进行qRT-PCR分析。内参选择GAPDH。用2法测定基因的相对表达量。分别进行了3次独立的实验。引物序列见于表1。

2.6 GelMA-Exo明显促进大鼠软骨损伤的修复

动物模型建立4周后，采集动物膝关节标本进行HE和Msaaon染色（图6）。染色显示假手术组关节软骨清晰，表面光滑完整。单纯损伤组关节软骨损伤区域出现较大的软骨缺损、断裂，基本很少有再生的软骨。相比于单纯损伤组，GelMA组和GelMA-Exo组修复效果良好，且GelMA-Exo组修复效果大于GelMA组。

我国古籍浩如瀚海，不可斗量，属于地名专著的却寥如晨星，含有地名内容的绝大多数信息散落于各种古代文选中，至于地名命名原则更是大海捞针，然而正是由于陈桥驿先生的深入探求，才确立了我国古代著作中出现的地名命名原则。

3 讨论

研究认为软骨损伤所产生的炎症环境对软骨细胞的死亡和肥大、细胞外间质破裂、异位骨形成以及软骨损伤进展到骨关节炎是至关重要的。M1巨噬细胞及其分泌的炎症因子能抑制骨髓间充质干细胞的增殖、活性以及软骨分化，从而加速ECM 的降解。研究表明CD14巨噬细胞和促炎细胞因子能抑制骨关节炎滑膜衍生干细胞（SDSC）向软骨分化，并且他们发现IL-1β和TNF-α显着抑制SDSCs 中软骨形成基因的表达。mTORC1通过驱动M1巨噬细胞的极化来促进肥大软骨细胞的发育和成熟。总的来说，这些发现表明M1巨噬细胞不利于软骨修复，促进巨噬细胞由M1型向M2型转化将有利于软骨损伤的修复。

本文考虑到主客观赋权法存在的缺点与不足，立足于主客观结合赋权方法的现状，采用层次分析法与熵权法相结合的赋权方法，确定了汾河流域节水灌溉水平综合评价体系中各个指标的综合权重，将专家的经验知识和各个数据信息充分结合，既体现了专家的个人意向，实现了专家个人偏好的合理表达，又能反映指标的客观特性，具有较强的实用性和可操作性。可为相关评价体系指标权重的确定提供参考。

外泌体携带各种蛋白质、脂质和各种非编码RNA，特别是miRNA，具有良好的免疫调节作用。此外，BMSCs来源的外泌体已被证明可以诱导细胞外调节蛋白激酶和蛋白激酶B通路的快速磷酸化，促进细胞增殖和迁移，与CCK8结果一致。有学者将骨髓干细胞来源的外泌体注射到大鼠关节腔内用于缓解关节炎的进展。然而，骨髓干细胞外泌体是否可以通过调控免疫而促进软骨损伤的修复却很少有文献报道。本研究利用GelMA水凝胶联合骨髓干细胞来源外泌体，用于软骨损伤的治疗。材料学表征表明我们成功合成了GelMA水凝胶，是一个稳定的粘弹性固体，弹性模量满足体内应用的条件，并且外泌体成功负载到GelMA水凝胶上。GelMA水凝胶在某些性质上与天然ECM相似，具有良好的生物相容性，可充当外泌体的理想载体，与实验结果一致。GelMA水凝胶的多孔表面和亲水特性也有利于细胞粘附。此外，动物实验表明GelMA水凝胶也能促进软骨的修复，这可能归功于它的ECM成分。外泌体在GelMA水凝胶内释放持续了14 d，且超过80%的外泌体从水凝胶中释放出来，这确保了最佳的生物治疗效果。相比于外泌体一过性的释放，水凝胶的缓释作用能使外泌体长时间发挥生物学功能。将RAW 细胞与不同样品共培养，Exo 组和GelMA-Exo组在第3天没有差异而第7天出现差异，表明缓释的外泌体具有更强的调节作用。

在软骨损伤过程中，静息的巨噬细胞可被刺激分化为M1和M2亚群，M1亚群主要参与炎症的早期阶段，而M2亚群主要参与修复阶段。M1巨噬细胞表面的模式识别受体蛋白和Toll样受体蛋白可识别关节腔内的损伤相关分子模式，激活NF-κB 信号通路，从而促进炎症因子的释放。本研究表明负载外泌体的GelMA水凝胶可以有效抑制iNOS和TNF-α的表达，并促进巨噬细胞由M1型向M2转化。根据我们先前的研究，外泌体内所含的各种蛋白质、脂质以及非编码RNA，特别是miR-199a，它可以通过抑制NF-κB 通路来调节免疫功能。

进一步我们通过建立Transwell 共培养模型发现负载外泌体的GelMA水凝胶能够通过调控免疫进而促进SOX-9 和COL-2 的表达，而抑制MMP-13 的表达。SOX-9被认为是软骨形成的关键转录因子之一，可以调节软骨形成相关标志物（II型胶原）的表达和GAG 基质的形成。M1型巨噬细胞释放的TNF-α和IL-1β等促炎因子可以通过降低炎症环境中软骨形成转录因子SOX9 mRNA的水平来抑制软骨形成基因的表达。此外，炎症免疫细胞产生的炎症因子如IL-1β、iNOS 和TNF-α会导致基质蛋白酶如MMP-1和MMP-13过度表达，进而导致软骨细胞凋亡和基质降解。M2巨噬细胞，也称为创伤修复巨噬细胞，其分泌的许多抗炎分子，包括Arg-1、IL-10等，为软骨细胞修复创造了一个必要的抗炎环境，抑制了MMP-13的表达，从而促进了损伤软骨细胞的修复。

综上，本研究将骨髓干细胞来源的外泌体负载到GelMA水凝胶上，体外实验表明负载在水凝胶上的外泌体可以通过抑制炎症并且可以通过调节巨噬细胞的M2极化来减轻炎症对软骨细胞的抑制作用，从而促进软骨ECM的合成。同时，体内实验表明负载外泌体的GelMA有利于大鼠软骨损伤的修复。本研究将有望为临床治疗软骨损伤提供一种新思路。