三七总皂苷联合环磷酰胺对荷肝癌H22细胞移植瘤小鼠的治疗作用

原发性肝癌（HCC）简称肝癌，据统计，每年全球约有100多万人被诊断为肝癌。原发性肝癌在我国的发病率居恶性肿瘤谱的第4位，死亡率居第2位，因恶性程度高，进展迅速，患者的5年生存率仅12.1%。HCC的治疗包括手术切除、肝移植、经导管动脉化疗栓塞术和射频消融术，辅以全身性化疗、靶向药物治疗等，但针对无法切除的中晚期HCC患者可供选择的治疗方式非常有限，亟待新的治疗策略，中西医结合治疗方案已是当今HCC研究的热点问题。

三七为五加科人参属植物三七Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根茎，是珍贵的道地药材。其主要成分PNS被广泛的应用于心脑血管疾病和血液系统疾病。PNS能增强机体免疫力、减轻化疗药的毒副作用和抗肿瘤作用，抗肿瘤作用主要集中在体外对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响，体内抗肿瘤研究相对较少，其可通过增强机体免疫力发挥抗肿瘤作用，而增强免疫力指标的检测主要针对免疫器官和免疫细胞因子，对其他免疫指标的报道较少。课题组长期从事三七活性成分抗肝癌的研究，目前未见PNS及PNS与CTX联用对肝癌H荷瘤小鼠机体免疫力、抑瘤率和生存期的研究，本研究拟从以上3个方面探讨PNS及PNS联合CTX对肝癌H荷瘤小鼠的治疗作用，将其作为肝癌辅助用药提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂

PNS（云南西草生物科技开发公司，批号：20200802）、CTX（安道生）、15%绵羊红细胞SRBC（Solarbio）、红细胞裂解液（Solarbio）、胎牛血清（Gibco）、RPMI 1640（Gibco）、ConA（Solarbio）、印度墨汁（Solarbio）、生理盐水（昆明南疆制药有限公司）、豚鼠血清（Solarbio）、TNF-α试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、IL-2试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、凋亡试剂盒（杭州联生物技术股份有限公司）

1.2 仪器与设备

Partec 流式细胞仪（Partec）、Bio-rad MODEL680型酶标仪（Bio-rad）、TGL 18C低温高速离心机（湖南湘立有限公司）、XT-2000i型全自动血细胞分析仪（Sysmex）、EDTA-K抗凝管（湖南省浏阳市医用仪具厂）。

1.3 实验动物

SPF级昆明小鼠，雌性，标准体质量（18～22 g），昆明医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（滇）2015-0002。本研究涉及到的动物实验均已通过昆明医科大学实验伦理审查委员会的伦理审查。

1.4 细胞株

小鼠肝癌H细胞（购于国家实验细胞资源共享平台，保存于昆明医科大学云南省暨天然药物药理重点实验室）。

1.5 CCK8法测定PNS对肝癌H22细胞增殖抑制的影响

末次给药后，禁食不禁水，经尾静脉注射用生理盐水稀释4倍的印度墨汁，剂量0.1 mL/10 g，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10 min，分别从小鼠内眼眦静脉丛取血20 μL，加入到2 mL 0.1%NaCO溶液中摇匀。以NaCO溶液作空白对照，测光密度值，各设3个平行孔。将小鼠处死，取肝、脾脏称重。按下式计算吞噬指数α。

肿瘤边缘相对清晰的有8例，边界全部或部分不清的有9例患者肿瘤周围脂肪间隙消失。肿瘤累及肠系静脉、动脉、胰腺的有4例。胃肠道间质瘤附近呈线性增厚的有1例，CT增强扫描表现为明显强化。

山东男篮早期的外援，以实用廉价的东欧球员为主。2000年跟随外教利马斯来的后卫达柳斯，以及后来入队的立陶宛同胞、中锋洛兰达斯，给人留下了很深刻的印象。两人虽然并不算是大牌球员，但作风强硬技术扎实。虽然位置不同，但都能组织也能得分，深得球迷的喜欢。也正是他们，给山东队带来了欧洲整体篮球的理念，减少了对球星的依赖。

第八，多种措施开源，特别是要利用好非常规水资源。比如说雨洪资源的利用，现在我们在这方面做了一些工作，在保障安全的前提下，尽可能把汛期的洪水蓄积利用起来。城市现在也搞了雨污分流，充分利用雨水资源。还有中水回用的潜力也非常大。现在每年城市供水总量是507.9亿m3，污水处理量331亿m3，但是中水回用量只有33亿m3，仅相当于1/10。所以说，下一步中水回用是弥补水资源不足的有效途径。北京市在这方面做了很多工作，2011年用水量36亿m3，其中中水回用7亿m3。下一步我们还要加大力度，通过开源节流并重、管理并举，提高水资源利用效率和效益，有效应对农业水资源短缺的问题。

1.6 Annexin V/PI双荧光染色法观察PNS对肝癌H22细胞凋亡率的影响

设置PNS 低（200 μg/mL）、中（400 μg/mL）、高（800 μg/mL）3 个剂量组及生理盐水阴性对照组，取对数生长期的肝癌H细胞1×10/mL接种于6孔板，药物作用24、48 h后，用预冷PBS离心洗涤，收集1×10～10×10细胞。严格按照试剂盒说明书操作，最后于流式细胞仪上检测正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞的百分比。

1.7 建立肝癌H22荷瘤小鼠模型

取传至第3代的肝癌H细胞腹腔培养小鼠，用棉球蘸取75%乙醇擦拭小鼠腹部，无菌条件下，将注射器中的生理盐水注射液推至小鼠腹腔，抽取腹水，重复几次操作，得肝癌H细胞混悬液适量。取20 μL细胞悬液于干净的EP管中，加入1980 μL生理盐水，混匀，记数，细胞活率＞95%用于实验，以1.0×10/mL、0.2 mL/只，右前肢腋下接种于SPF级昆明种雌性小鼠，正常组不接种。

1.8 分组与给药

将SPF级昆明种雌性小鼠随机分为9组，依次为（1）正常组、（2）模型组、（3）PNS低剂量组（120 mg/kg）、（4）PNS中剂量组（240 mg/kg）、（5）PNS高剂量组（480 mg/kg）、（6）CTX 组（25 mg/kg）、（7）PNS 低剂量（120 mg/kg）+CTX组（25 mg/kg）、（8）PNS中剂量（240 mg/kg）+CTX组（25 mg/kg）、（9）PNS 高剂量（480 mg/kg）+CTX 组（25 mg/kg）。第（2）组至第（9）组小鼠右腋皮下接种肝癌H细胞悬液0.2 mL/只，接种后，同1 d，（1）、（2）、（6）组小鼠灌胃给予生理盐水，其他组灌胃给予相应浓度的药物，0.1 mL/10 g，连续给药10 d，同1 d第（6）组至第（9）组小鼠腹腔注射CTX药物溶液，0.1 mL/10 g，连续注射10 d。

1.9 肝癌H22荷瘤小鼠碳廓清实验

收集第3代处于对数生长期的肝癌H细胞于15 mL的离心管中，离心、洗涤、稀释、记数，将细胞浓度调至6×10/mL，接种于96孔板，100µL/孔，共种3块板，将96孔板放至CO孵箱中孵育4 h后，取出后分别加入不同浓度的PNS 溶液，使其终浓度依次为0、100、200、300、400、500、600 μg/mL的PNS，设置5个复孔，同时设置空白孔，继续孵育24、48、72 h后，取出96孔板加入CCK8溶液10µL/孔，继续孵育4 h后，检测吸光度值，并计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（给药组平均-空白组平均）/（对照组平均-空白组平均）。

模型组的刺激指数显著低于正常组（＜0.01）；与模型组相比PNS低、中、高各组刺激指数均显著增强（＜0.01）；与CTX组相比，PNS低、中、高+CTX组的刺激指数均提高，且PNS中、高+CTX组差异具有统计学意义（＜0.05，表4）。

（为第1次血液采集的吸光度，为第2次血液采集的吸光度；T为第1次血液收集的时间，T为第2次血液收集的时间）。

广播影视主要是根据观众的需求以主动的方式给他们提供，自行选择收看节目的公共服务。在数字条件下，我们不但要提供公共服务，还要提供多样化、个性化的服务。因此，节目内容生产将面临前所未有的巨大需求和挑战，这就要求传播内容要适应社会发展，从封闭、分散、独立的传统服务模式向开放服务、个性化服务、信息聚合服务转变，按照社会化规律和市场的要求，进行结构调整、资源重组、合理分工、高效运行。

1.10 肝癌H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力的测定

末次给药后，禁食不禁水12 h，颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤组织，称质量。抑瘤率IR（%）=（1-治疗组平均瘤质量/生理盐水组平均瘤质量）×100%。

小鼠脾淋巴细胞增殖活性检测（MTT法）：小鼠脾细胞悬液（3×10/mL）按100 μL/孔，接种于96孔培养板，各样本设刺激孔及对照孔，各设3复孔，刺激孔加入含20 μg/mL 的ConA 培养液100 μL，对照孔加入RPMI 1640培养基100μL，置于37 ℃，5%CO培养箱44 h，取出，于无菌超净工作台避光加入20μL/孔的MTT（5 mg/mL）继续培养4 h后，终止反应，加入100 μL/孔的三联液溶解紫色结晶。8～12 h后用酶标仪测吸光度值，计算刺激指数（SI）∶SI=刺激孔/对照孔。

1.11 ELISA法测定肝癌H22荷瘤小鼠TNF-α、IL-2的水平

末次给药后，禁食不禁水12 h，小鼠摘眼球采血，样本由1.5 mL干燥的EP管收集，4 ℃，4000 r/min离心10 min，取上清，待测。采用ELISA法测定小鼠血清中TNF-α、IL-2严格按试剂盒说明书的要求操作。

1.12 肝癌H22荷瘤小鼠血清溶血素的测定

案例5 假定有一组变量，其中X1，X2，X3，X4是自变量，Y是因变量，自变量对因变量有影响，测得的数据如表14.试求Y对X1，X2，X3，X4的最佳线性模型.

随着国内赛事经济的红火，体育赛事转播权这一“新兴事物”引起了业界内外人士的高度关注。近有咪咕视频和优酷网从央视手中高价购得2018年世界杯的新媒体转播权；远有体奥动力体育传播有限公司斥资80亿购买5年的“中超版权”。然而本文细究后发现，无论是对体育赛事转播权的界定，还是它的保护方式都众说纷云。换言之，体奥动力等公司以80亿元天价所购得的究竟是什么东西，是否属于法律意义上的“权利”，在目前的法律语境中尚未有定论。故本文希望厘清：体育赛事转播权并非局限于知识产权领域的权利；它的法律保护路径需要在更为宏观的视野下才能绘制成型。

1.13 肝癌H22荷瘤小鼠血液指标的测定

与阴性对照组比较，各给药组细胞凋亡率显著升高（＜0.01，表2、图2），PNS对肝癌H细胞凋亡作用呈浓度和时间依赖性，800 μg/mL、作用48 h 凋亡率达92.77%。

1.14 肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤率的测定

小鼠脾淋巴细胞的制备：无菌条件下分离小鼠脾脏，剔除脂肪和结缔组织，置于盛有适量无菌生理盐水的培养皿中，用玻片研碎，经300目筛网过滤，收集滤液，1000 r/min离心10 min，加入3倍体积红细胞裂解液，置冰上裂解10 min后，1000 r/min离心10 min后弃上清液，RPMI 1640培养基洗涤离心细胞2次，用2 mL完全培养液重悬，计数活细胞，调整细胞数为3×10/mL。

该替换，讲ω=0映射到ω=±∞，反之亦然；截止发生在低通截止频率。即转换了电容与电感，串联电感用电容表示，并联电容由电感替代。新的元件值为：

在给药的第7 天，每只小鼠腹腔注射2%绵羊红细胞0.2 mL进行致敏，并继续给药。连续免疫4 d，末次给药后，禁食不禁水12 h，摘除小鼠的眼球，取血于离心管内，放置约1 h，4 ℃，4000 r/min，离心10 min，收集血清。另于试管内依次加入经稀释100倍的1 mL血清、10%SRBC 0.5 mL、1 mL 10%补体。用相同体积的生理盐水代替血清样品，制备空白对照。摇匀试管中的溶液后，置37 ℃水浴中保温30 min，然后移至冰浴中终止反应，2000 r/min，离心10 min，吸取上清液200 μL于96孔透明板，用酶标仪测定值。

1.15 肝癌H22荷瘤小鼠生存期的测定

各组小鼠最后任其自然死亡，观察记录小鼠状态及死亡情况，计算各组荷瘤小鼠平均存活天数和生命延长率。生命延长率（%）=（实验组平均存活时间-对照组平均存活时间）/对照组平均存活时间×100%。

1.16 统计学分析

采用SPSS26.0统计软件进行分析，计量资料符合正态性的以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PNS对肝癌H22细胞的增殖抑制作用

PNS呈浓度依赖性抑制肝癌H细胞的增殖，浓度为600 μg/mL，作用48 h时抑制率高达91.22%，作用效果明显（＜0.01，表1、图1）。

2.2 PNS对肝癌H22细胞凋亡的影响

末次给药后，禁食不禁水12 h，剪除小鼠右边的胡须，摘除眼球取血0.5 mL，储存于EDTA-K抗凝管，用XT-2000i型全自动血细胞分析仪测血常规。

进一步加强对于牧区牧民的知识培训和教育，提高牧民对于牦牛的饲养和管理水平，减少由于疫苗免疫失败和对于牦牛的生存环境不重视以及饲养不合理而出现的病毒感染，最大程度上减少不必要的疫病风险。

2.3 PNS和PNS+CTX对肝癌H22荷瘤小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力的影响

与模型组相比，PNS低、中、高各组的单核-吞噬指数均增加，且PNS 中、高组差异具有统计学意义（＜0.05）；CTX组吞噬指数低于正常组（＜0.05，表3），与CTX组相比，PNS低、中、高+CTX组吞噬指数增加，且PNS中、高+CTX组差异具有统计学意义（＜0.05）。

2.4 PNS和PNS+CTX对肝癌H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

α=K×体质量/（肝质量+脾质量）；K=（Lg-Lg）/（T-T）

2.5 PNS和PNS+CTX对肝癌H22荷瘤小鼠免疫细胞因子的影响

与模型组相比，PNS低、中、高剂量组的TNF-α水平增加，PNS 低剂量组差异具有统计学意义（＜0.05），PNS 中、高剂量组TNF-α水平显著增加（＜0.01）；与CTX 组相比，PNS+CTX 组差异具有统计学意义（＜0.05），且PNS中、高+CTX组水平显著增加（＜0.01）。与模型组相比，PNS低、中、高剂量组的IL-2水平增加，且PNS中、高剂量组差异具有统计学意义（＜0.05）；与CTX组相比，联合各组的IL-2水平增加，PNS中、高剂量+CTX组差异具有统计学意义（＜0.05，表5）。

2.6 PNS和PNS+CTX对肝癌H22荷瘤小鼠血清溶血素含量的影响

与模型组比较，PNS低、中、高各组血清中溶血素抗体含量升高，促进抗体的生成；与CTX组比较，PNS低、中、高+CTX各组的血清溶血素抗体水平升高，且PNS高+CTX组具有统计学差异（＜0.05，表6）。

4)用电运行成本是否交优：例如工业锅炉需要高温以利用，通过比较发现利用电能的成本和用煤炭的成本相比还是较高。但是通过相关技术突破、能源枯竭以及电力市场发展，用电代替煤炭会有经济优势。

2.7 PNS和PNS+CTX对肝癌H22荷瘤小鼠血液指标的影响

与模型组相比，CTX组中白细胞、淋巴细胞、红细胞数量减少（＜0.05，＜0.01），PNS低、中、高剂量组白细胞、淋巴细胞、红细胞数量增加，且PNS高剂量中白细胞数量差异具有统计学意义（＜0.05）；与CTX组相比，PNS低、中、高+CTX各组白细胞数量增加（＜0.05，表7），淋巴细胞、红细胞数量也有所增加。

2.8 PNS和PNS+CTX对肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响

与模型组相比，PNS 低剂量组的瘤重降低（＜0.05），其他各组的瘤重均显著降低（＜0.01）；与CTX组相比，PNS低、中、高+CTX组的瘤重均显著降低，呈剂量依赖性（＜0.01，表8，图3）。

2.9 PNS和PNS+CTX对肝癌H22荷瘤小鼠生存期的影响

与模型组相比，PNS低剂量组能延长肝癌H荷瘤小鼠的生存期（＜0.05），其他各组荷瘤小鼠的生存期均明显延长（＜0.01）；联合给药各组的生存期均比单用两药的高，且其中PNS 高+CTX 组荷瘤小鼠生存期与CTX组比较具有统计学差异（＜0.05，表9，图4）。

3 讨论

肝癌治疗效果较差，大多数肝癌患者诊断时已为中晚期，错过了最佳手术治疗时期，化疗仍然是中晚期肝癌治疗的重要方式之一。化疗药作为癌症的治疗药物，有严重的毒副作用，如化疗药CTX对骨髓、免疫系统、消化系统、肝、肾等毒副作用大，甚至直接或间接导致患者死亡。中药治疗癌症具有毒副作用小、提高免疫力、减轻放化疗副作用、延长生存期等特点，对肝癌患者的治疗具有重要意义。

PNS对肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7404细胞都有抑制及促进凋亡的作用。实验发现PNS也能抑制肝癌H细胞的增殖和促进其凋亡（＜0.01），PNS体外具有明显的抗肝癌作用，冯晓异等的结果与本实验的一致。

PNS能增强机体免疫力，从而达到抗肝癌作用。单核-巨噬细胞是机体质量要的免疫细胞，能反应机体的非特异免疫力强弱。通过碳廓清实验考察PNS对单核-巨噬细胞吞噬能力的影响，发现PNS可提高肝癌H荷瘤小鼠单核-巨噬细胞吞噬速率，PNS联合CTX的单核-巨噬细胞的吞噬速率优于单用CTX（＜0.05），PNS能改善CTX对机体的非特异性免疫损伤。PNS能促进肝癌H荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖，联合给药各组的脾淋巴细胞的增殖能力也比单用CTX的高（＜0.05），增强细胞免疫能力。PNS与CTX联用能刺激S荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖。同时发现PNS可促进肝癌H荷瘤小鼠血清溶血素抗体的产生，联合给药各组的血清溶血素抗体水平也比单用CTX的高（＜0.05），PNS能改善CTX对机体的体液免疫的损伤。PNS能增加S荷瘤小鼠TNF-α和IL-2的水平，从而参与机体免疫调节。实验表明PNS可提高肝癌H荷瘤小鼠TNF-α和IL-2的水平，且联合给药各组的TNF-α和IL-2的水平比单用CTX的高（P＜0.05），PNS能刺激细胞因子的释放参与免疫调节。PNS和PNS联合CTX均增加肝癌H荷瘤小鼠外周血中白细胞、淋巴细胞、红细胞的数量，保护血液系统。最后，发现PNS和PNS联合CTX能抑制肝癌H荷瘤小鼠肿瘤的生长和延长肝癌H荷瘤小鼠的生存期，联合用药具有更加的治疗效果，其中PNS高剂量+CTX 组抑瘤率高达83.28%（＜0.01）、生命延长率达131.25%（＜0.05）。

综上，实验首次从免疫的角度研究PNS对肝癌H荷瘤小鼠的免疫系统的影响，结果表明PNS可提高肝癌H荷瘤小鼠的非特异性和特异性免疫力，从而达到抗肿瘤作用、延长肝癌H荷瘤小鼠生存期。首次考察PNS联合CTX联用对肝癌H荷瘤小鼠的治疗作用，结果表明联合用药能改善CTX对机体非特异性和特异性免疫力的损伤，减轻CTX的不良反应，增强其抗肿瘤效果、延长生存期，有明显的增效减毒作用，PNS与化疗药联用于肝癌患者具有良好应用前景和研究价值。