基于网络药理学方法探讨玉屏风散治疗慢性阻塞性肺疾病的分子机制研究

陈明辉，王琼萍，蒋慧，马少欣

中国科学院大学深圳医院(光明)呼吸与危重症医学科，广东深圳 518106

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的生理病理特征之一为出现分泌过量的气道黏液，可引发细菌定植、气体交换下降、通风灌注错配、气流受限、气道阻塞，进而出现肺功能进展性下降[1]。分泌过高的气道黏液与黏液蛋白/水盐比例紊乱密切相关，其中水通道蛋白5（AQP5）负责转运肺泡内水及调节黏蛋白/水盐比例，而黏蛋白5（MUC5AC）决定了黏液的黏度。 研究发现，慢性阻塞性肺疾病的AQP5 表达明显下降，而MUC5AC 的表达则增高显著[2]。 现代药理研究发现，玉屏风散中药有效成分可促进气管液体分泌量增高，促进排出痰液。该研究通过观察基于网络药理学方法分析慢性阻塞性肺疾病予以玉屏风散治疗的分子机制研究，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

广州中医药大学动物实验中心提供70 只SD健康大鼠 （生产许可号：SCXK （粤）2013-0034），12周鼠龄，体质量（200±20）g，无特定病原体级实验动物， 实验前予以7 d 适应性喂养， 保持实验湿度为60%，实验温度为20°C；实验动物分组：分为7 组、玉屏风中药低、中、高剂量组、泼尼松组、模型组、正常对照组，低剂量为临床等效剂量，根据动物体表等效剂量换算法，计算小鼠给药剂量及总的用药量，高、中、低剂量给药量分别约为：0.65 g/mL、0.325 g/mL、0.162 5 g/mL，2 mL/d。 泼尼松联合玉屏风散中药中剂量组，每组10 只，雌雄各半。

1.2 主要药品与试剂

①美国Sigma 公司提供的脂多糖， 与生理盐水配制浓度为1 mg/mL。 ②玉屏风散水煎剂:玉屏风散药材由中国科学院大学深圳医院（光明） 中药房提供，为《中国药典》所载合格品种。称取防风、炒白术均为60 g，180 g 黄芪，碾碎防风，白术、黄芪和防风药渣均加入8 倍量水，予以30 min 浸泡，两次煎煮；第1 次煎煮时间为1.5 h，第2 次为1 h，药液混合，过滤；药渣加入70%乙醇形成沉淀，上清液采集，乙醇减压回收，搅拌加水，静置；滤过上清液，水浴70～80°C，防风挥发油加入，混匀，4°C 置存。 实验时稀释成生药浓度0.65 g/mL、0.325 g/mL、0.162 5 g/mL。 ③泼尼松片。④自制密闭造模箱：大小50 cm×50 cm×50 cm，木质箱体。

1.3 方法

筛选有效成分：①利用网络药理学数据库，收集玉屏风散的全部化学成分。 ②利用网络-药物-靶点分析， 寻找玉屏风散的化学成分和水通道蛋白的靶基因的调节通道。 ③利用UniPOT 和CTD 等数据库寻找基因-疾病的对应关系，通过系统筛选出与本项目研究的相关靶基因与靶蛋白及相关炎症介质。 ④通过计算机SYBYL 软件，进一步优化、过滤、构象玉屏风散的全部分子，并计算出靶点蛋白的配体，利用药物-蛋白配体分析出全部分子与靶点蛋白的关系，计算出相关通道的炎症介质调节关系， 筛选出最有可能具有药理活性的有效成分。

COPD 动物模型建立。 ①造模方法：COPD 肺虚型模型建立方法为脂多糖气管内滴注， 同时予以香烟吸熏法。 ②给药： 大鼠从造模当天起每天灌胃给药。 正常对照组及模型组2 mL/d 生理盐水灌胃，玉屏风组:玉屏风组高、中、低剂量组分别给予每天予2 mL生药浓度0.65 g/mL、0.325 g/mL、0.162 5 g/mL 的玉屏风汤剂灌胃，泼尼松组：灌胃2 mL 生理盐水，3.15 mg/kg 泼尼松片； 与玉屏风散中药剂量组联用：泼尼松（3.15 mg/kg）溶于2 mL 中剂量组玉屏风散汤剂灌胃；用药时间共3 个月。

样本采集及指标观察：①大鼠的动态观测：实验期间，认真观察各组大鼠的呼吸（有无咳嗽、气急、喘鸣等）。动态观察各组大鼠的体质量变化。②HE 肺组织检测玉屏风散中药的有效成分对COPD 肺组织结构的影响。③Western Blot 检测玉屏风散中药的有效成分对COPD 体内中AQP5-MUC5AC 蛋白表达的影响。Western blot 方法监测：剪碎组织100 mg，核裂解缓冲液A400 mL 内，研磨，15 000 g，4°C，0°C 涡旋10 min， 胞浆蛋白为上清液；50 μl 冷的核裂解缓冲液B 中，0℃涡旋30 min，4℃，15 000 g 离心10 min，上清液采集，-80°C 置存。 ④RT-PCR 检测玉屏风散中药的有效成分对COPD 体内中AQP5-MUC5AC mRNA 表达的影响：采用Trizol 提取肺组织总RNA，测定A260 和A280 处的OD 值， 判断RNA 的纯度和定量。 将RNA 逆转录为cDNA：RNA 样品冰上解冻；DEPC 水18 μl 稀释RNA 样品2 μl；检测前重新上机定量RNA 浓度；PCR 扩增反应。

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0 统计学软件分析数据。 计量资料符合正态分布，以（±s）表示，组间差异比较以t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western Blot 检 测 肺 组 织 中AQP5、MUC5AC蛋白的表达

除正常对照组外， 泼尼松联合玉屏风中剂量组的AQP5 蛋白指标明显高于其他各组， 差异有统计学意义 （P＜0.05）； 玉屏风散组随着剂量的增加，AQP5 蛋白含量逐渐增高， 差异有统计学意义 （P＜0.05）；除正常对照组外，泼尼松联合玉屏风中剂量组的MUC5AC 蛋白指标明显低于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05）；玉屏风散组随着剂量的增加，MUC5AC 蛋白含量逐渐减低， 差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 Western Blot 检测肺组织中AQP5、MUC5AC 蛋白的表达（±s）

表1 Western Blot 检测肺组织中AQP5、MUC5AC 蛋白的表达（±s）

注：a 为与泼尼松联合玉屏风中剂量组相比，b 为与玉屏风高剂量组相比，P<0.05

组别AQP5 蛋白 MUC5AC 蛋白玉屏风高剂量组（n=10）玉屏风中剂量组（n=10）玉屏风低剂量组（n=10）模型组（n=10）正常对照组（n=10）泼尼松组（n=10）泼尼松联合玉屏风中剂量组（n=10）（0.42±0.10）a（0.31±0.08）ab（0.28±0.06）ab（0.17±0.01）a 0.63±0.18（0.25±0.02）a 0.59±0.16（0.31±0.07）a（0.43±0.08）ab（0.52±0.11）ab（0.63±0.16）a 0.25±0.04（0.60±0.13）a（0.27±0.05）a

2.2 RT-PCR 法检测肺组织中AQP5、MUC5AC mRNA 的表达

除正常对照组外， 泼尼松联合玉屏风中剂量组的AQP5 mRNA 指标明显高于其他各组， 差异有统计学意义（P＜0.05）； 玉屏风散组随着剂量的增加，AQP5 mRNA 逐渐增高， 差异有统计学意义 （P＜0.05）；除正常对照组外，泼尼松联合玉屏风中剂量组的MUC5ACmRNA 指标明显低于其他各组， 差异有统计学意义（P＜0.05）；玉屏风散组随着剂量的增加，MUC5ACmRNA 逐渐减低， 差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 RT-PCR 法检测肺组织中AQP5、MUC5AC mRNA 的表达（±s）

表2 RT-PCR 法检测肺组织中AQP5、MUC5AC mRNA 的表达（±s）

注：a 为与泼尼松联合玉屏风中剂量组相比，b 为与玉屏风高剂量组相比，P＜0.05

组别AQP5 mRNA MUC5AC mRNA玉屏风高剂量组（n=10）玉屏风中剂量组（n=10）玉屏风低剂量组（n=10）模型组（n=10）正常对照组（n=10）泼尼松组（n=10）泼尼松联合玉屏风中剂量组（n=10）（2.42±0.11）a（2.33±0.07）ab（2.26±0.05）ab（1.23±0.01）a 2.53±0.21（1.25±0.02）a 2.48±0.19（1.32±0.07）a（1.45±0.09）ab（1.52±0.12）ab（2.72±0.19）a 1.23±0.02（1.63±0.14）a（1.25±0.03）a

3 讨论

该研究观察基于网络药理学方法分析慢性阻塞性肺疾病予以玉屏风散治疗的分子机制研究， 结果显示：除正常对照组外，泼尼松联合玉屏风中剂量组的AQP5 蛋白、mRNA 明显高于其他各组（P＜0.05）；玉屏风散组随着剂量的增加，AQP5 蛋白、mRNA 逐渐增高（P＜0.05）；除正常对照组外，泼尼松联合玉屏风中剂量组的MUC5AC 蛋白 （0.27±0.05）、mRNA（1.25±0.03）指标明显低于其他各组（P＜0.05）；玉屏风散组随着剂量的增加，MUC5AC 蛋白、mRNA 含量逐渐减低（P＜0.05），与邓秀娟等[3]的研究结果大体一致， 在其研究中， 联合组MUC5AC 蛋白为 （0.22±0.04） 低于其他各组。 该研究基于网络药理学数据库、 基于利用网络-药物-靶点分析、 通过计算机SYBYL 软件，进一步优化、过滤、构象玉屏风散的全部分子，并计算出靶点蛋白的配体，利用药物-蛋白配体分析出全部分子与靶点蛋白的关系， 计算出相关通道的炎症介质调节关系， 筛选出最有可能具有药理活性的有效成分[4-6]。 玉屏风散主要治疗风邪袭表，卫外不固，其中白术益气健脾，佐以防风散风邪，黄芪则止汗固表， 补脾肺之气；AQP5 具有传代、培养速度快、高稳定性，可分泌合成黏液等特征，广泛应用于气道高分泌黏液体外研究中[7-9]。 研究发现，COPD 中的AQP5 蛋白指标明显下降， 而MUC5AC蛋白指标异常增殖， 经玉屏风散干预治疗后，AQP5蛋白显著增高，而MUC5AC 蛋白则明显增高，说明COPD 经玉屏风散干预治疗后可对MUC5AC 的表达进行抑制，同时促进大鼠肺组织AQP5 的表达[10-15]。

综上所述， 慢性阻塞性肺疾病进行玉屏风散治疗，可促使肺组织中的AQP5 蛋白增高，而MUC5AC蛋白水平下降，纠正黏蛋白/水盐比例紊乱是其治疗COPD 的分子机制。