miR-125b-5p靶向调控p53及PDCD4表达对心力衰竭合并心房颤动大鼠心肌细胞凋亡的影响

秦洁 郭宇 杨华 杨晨涛

心力衰竭（heart failure，HF）在老年人群中越来越常见，并且HF患者常伴有心房颤动（atrial fibrillation，AF）。AF是一种常见的持续性心律失常，与显著增加的住院率、发病率和死亡率相关[1]，目前已有多种治疗方法可以提高患者的生存率，但其治疗机制并不明确，因此分析HF合并AF的发病机制具有重要意义。微小 RNA（microRNA，miRNA，miR）是一种短小的、非编码的单链RNA，其可在转录后的水平上调控基因表达[2]。有体外研究显示，miR-125b-5p具有抑制HF心肌细胞凋亡的作用[3]，但其在体内对HF合并AF心肌细胞的影响仍不清楚。程序性死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是细胞凋亡的关键诱导因子，有研究发现PDCD4被miRNA抑制后，HF心肌细胞凋亡率降低[4]。p53也是调节细胞存活、凋亡的多功能蛋白，有研究显示抑制p53表达能保护HF大鼠的心功能[5]。本研究通过建立HF大鼠模型并诱导发生AF，旨在探讨miR-125b-5p通过靶向p53及PDCD4的表达来调控HF合并AF心肌细胞凋亡的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF级成年雄性SD大鼠（南京金陵医院）55 只，体重 230～250 g。心肌细胞 H9C2（CRL-1446，美国ATCC公司）。试剂：miR-125b-5p类似物（miR-125b-5p mimic）和阴性对照（miR-125b-5p NC）（上海吉玛制药技术有限公司，1 mg/ml，注射制剂）。HE染色、TUNEL法和ELISA试剂盒（美国Roche公司）。RNAspin Mini和miRNeasy Mini试剂盒（美国GE Healthcare公司）。BestarTMqPCR试剂盒（德国DBI Bioscience公司）。TaqMan miRNA试剂盒（美国Thermo Fisher公司）。抗-PDCD4（ab79405）、抗-p53（ab32389）和辣根过氧化物酶偶联的二抗（ab6721）（美国Abcam公司）。化学发光试剂盒（美国Thermo Fisher公司）。DMEM培养基和抗体（美国Gibco公司）。pGL4荧光素酶载体（美国Promega公司）。pcDNA3.1 PDCD4、p53质粒、空载体（vector）、快速定点诱变试剂盒和Renilla荧光素酶质粒（中国Beyotime公司）。硝酸纤维素膜（默克公司）。Lipofectamine®2000（美国 Invitrogen公司）。仪器：HP SONOS 5500型的超声心动图仪（美国飞利浦公司）。心电图仪（澳大利亚PowerLab公司）。聚偏二氟乙烯膜（美国EMD Millipore公司）。显微镜（德国Carl Zeiss公司）。96孔、24孔组织培养板（美国康宁公司）。荧光素酶报告试剂盒和检测仪1000 System（美国Promega公司）。

1.2 大鼠建模、分组和干预方法 先通过射频消融诱导建立HF大鼠模型[6]。将40只大鼠使用4%水合氯醛麻醉，固定体位后气管插管（潮气量 20 ml/kg，呼吸频率50次/min）并连接心电图。随后开胸，撕开心包腔暴露心脏，使用导管在左心室的游离壁上进行射频消融1次（12 W，12 s）。然后，将心脏迅速放回胸腔内，简单缝合胸腔。待大鼠恢复意识后，以 12 h黑暗/12 h光照周期在笼子中饲养8周。8周后，采用超声心动图检查心功能，左心室射血分数（LVEF）＜45%视为HF建模成功。

再通过程序性电刺激诱导建立AF模型[7]。大鼠同上法麻醉、口气管插管，将一根 4-French四极导管穿过食管并放置在心房捕获阈值最低的部位，使用自动刺激器软件以35 s脉冲诱导房性心律失常的发生。每个脉冲串的周期长度为 20 ms，脉冲宽度为 5 ms。如果突发起搏后持续出现快速、不规则的心房节律至少2 s，视为AF建模成功。最终32只大鼠建模成功。选择其中30只采用随机数字表法分为miR-125b-5p组和模型组，每组15只。另取15只正常大鼠作为对照组，仅打开胸腔暴露心脏后缝合。miR-125b-5p组大鼠尾静脉注射miR-125b-5p mimic以提高miR-125b-5p 水平[8]，300 μg/次，1 次/周，连续 4 周。

1.3 观察指标

1.3.1 心功能和AF指标检测 12周后，采用超声心动图检查心功能，包括LVEF和左心室短轴缩短率（LVFS）。采用心电图检查AF诱导率和诱导时间。

1.3.2 大鼠心肌组织病理检查 完成上述检测后脱颈处死大鼠后取心肌组织，用10%甲醛溶液固定48 h，流水冲洗。95%乙醇脱水，然后将心肌组织浸入石蜡中制成蜡块，将其切成 4～7 μm厚度的切片，置于载玻片上，放置在 65℃恒温烘箱中 30 min，然后在二甲苯Ⅰ中 15 min、二甲苯Ⅱ中 15 min脱蜡。脱蜡切片用95%乙醇浸泡5 min，自来水冲洗10 min。然后将切片行HE染色后在光学显微镜下观察。

1.3.3 细胞凋亡检测 采用TUNEL法。石蜡包埋的心肌组织5 μm切片用二甲苯脱蜡2次，10 min/次，然后经过梯度乙醇脱水（乙醇浓度：100%、95%、90%、80%和70%）。切片在37℃潮湿暗箱中用50 μl的 TUNEL反应溶液处理 60 min后，加入50 μl链霉亲和素-HRP工作液孵育30 min。采用 DAPI对细胞核进行荧光染色，然后进行常规脱水、脱色和固定。检查细胞凋亡情况并使用光学显微镜捕获图像，计算TUNEL阳性细胞数的比例即为细胞凋亡指数（%）。

1.3.4 miR-125b-5p、PDCD4和p53 mRNA相对表达水平检测 采用RT-qPCR法。使用miRNeasy Mini试剂盒提取总miRNA，并通过TaqMan miRNA反转录试剂盒形成cDNA。然后使用TaqMan miRNA分析试剂盒测定miRNA表达水平。通过比较循环阈值并以U6作为内参，计算miR-125b-5p相对表达水平。使用RNeasy Mini试剂盒提取心肌组织中的总RNA。BestarTMqPCR试剂盒将其逆转录为cDNA，条件如下：37℃15 min，98℃ 5 min。然后使用BestarTMqPCR预混液进行qPCR实验，条件如下：95℃2 min，94℃20 s，58℃20 s，72℃20 s，40个循环，最后72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统进行RT-qPCR分析。通过比较循环阈值并以GAPDH作为内参，计算PDCD4和p53 mRNA相对表达水平。

1.3.5 PDCD4和p53蛋白相对表达水平检测 采用Westernblot法。心肌组织裂解后通过离心（4℃，12 000 r/min，5 min）收集总蛋白。通过8%SDS-PAGE分离每个样品中等量（50 μg）蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。在室温下将膜浸入5%脱脂牛奶中2 h封闭非特异性抗原。随后，将膜与抗-PDCD4和抗-p53在4℃下孵育过夜，然后将膜与相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1 h。使用化学发光试剂显示，以GAPDH作为内参，采用Quantum One软件分析灰度计算PDCD4和p53蛋白相对表达水平。

1.3.6 双荧光素酶报告实验 miR-125b-5p与PDCD4和p53的碱基结合位点通过工具网站得到（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）。将野生型（wt-）的PDCD4或者p53 mRNA的3'-非翻译区域的序列扩增到pGL4荧光素酶载体的下游位点，使用快速定点诱导试剂盒生成突变型（mut-）PDCD4或者p53。将H9C2细胞以3×104个/孔的密度接种在24孔板中，24 h后，使用Lipofectamine®2000将 1 μg的 wt-PDCD4/p53或者mut-PDCD4/p53荧光素酶质粒、50 nM的miR-125b-5p mimic或者 miR-125b-5p NC、150 ng的 Renilla荧光素酶质粒转染进入细胞。然后将细胞在37℃下孵育36 h。根据说明书，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。所有数据均以Renilla荧光素酶活性进行标准化。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；计数资料组间比较采用 χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠LVEF、LVFS的比较 3组大鼠LVEF、LVFS的差异均有统计学意义（均P＜0.01）。miR-125b-5p组LVEF和LVFS均高于模型组，模型组LVEF和LVFS均低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 3组大鼠LVEF、LVFS的比较（%）

2.2 3组大鼠AF诱导率和诱导时间的比较 3组大鼠AF诱导率和诱导时间比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。miR-125b-5p组的AF诱导率和诱导时间均低于模型组，模型组均高于对照组，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 2。

表2 3组大鼠AF诱导率和诱导时间的比较

2.3 3组大鼠心肌细胞病理检查结果 HE染色结果显示，miR-125b-5p组细胞排列异常和损伤情况均较轻。模型组心肌细胞形状发生改变，排列紊乱，细胞间隙变大，染色变浅，并出现纤维化状态。对照组心肌细胞排列整齐，细胞间隙均匀、清晰。见图1（插页）。

图1 miR-125b-5p对HF合并AF大鼠心肌损伤的影响（a：对照组；b：模型组；c：miR-125b-5p组；HE染色，×200）

2.4 3组大鼠心肌细胞凋亡情况的比较 正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈绿色。miR-125b-5p组可见部分细胞核固缩、呈绿色荧光，但绿色荧光细胞数目少于模型组，凋亡情况较模型组轻；模型组细胞密度较小，细胞核呈绿色荧光发亮、固缩；对照组心肌细胞密度较大且均匀分布，细胞核表现为均匀亮蓝色荧光；见图2（插页）。3组大鼠的心肌细胞凋亡指数比较差异有统计学意义（P＜0.01）。miR-125b-5p组的凋亡指数低于模型组，模型组高于对照组，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 3。

图2 miR-125b-5p对HF合并AF大鼠心肌细胞凋亡的影响（a：对照组；b：模型组；c：miR-125b-5p组；TUNEL染色，×400）

表3 3组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较（%）

2.5 3组大鼠miR-125b-5p、PDCD4和p53 mRNA相对表达水平的比较 3组大鼠心肌细胞中miR-125b-5p、PDCD4和p53 mRNA水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。miR-125b-5p组的miR-125b-5p高于模型组和对照组，PDCD4和p53 mRNA水平低于模型组（均P＜0.05），模型组的miR-125b-5p低于对照组，而PDCD4和p53 mRNA水平高于对照组（均P＜0.05），见表 4。

表4 3组大鼠miR-125b-5p、PDCD4和p53 mRNA相对表达水平的比较

2.6 3组大鼠PDCD4和p53蛋白相对表达水平的比较 3组大鼠心肌细胞中PDCD4和p53蛋白相对表达水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-125b-5p组的PDCD4和p53蛋白相对表达水平均低于模型组，模型组均高于对照组（均P＜0.05），见图3和表5。

图3 Western blot检测miR-125b-5p对HF合并AF大鼠PDCD4和p53蛋白相对表达水平的电泳图

表5 3组大鼠PDCD4和p53蛋白相对表达水平的比较

2.7 双荧光素酶报告实验验证miR-125b-5p与PDCD4的靶向关系 miR-125b-5p与PDCD4的靶向结合位点见图4。当转染共同转染wt-PDCD4和miR-125b-5p mimic后，细胞中的相对荧光素酶活性降低（P＜0.05），证明miR-125b-5p与PDCD4的靶向结合。见表6。

图4 微小RNA（miR）-125b-5p与程序性死亡因子4 mRNA的3'端的非翻译区域的结合位点

表6 双荧光素酶报告实验验证miR-125b-5p与PDCD4的靶向关系（相对荧光素酶活性）

2.8 双荧光素酶报告实验验证miR-125b-5p与p53的靶向关系 miR-125b-5p与p53的靶向结合位点见图5。当转染共同转染wt-p53和miR-125b-5p mimic后，细胞中的相对荧光素酶活性降低（P＜0.05），证明miR-125b-5p与p53的靶向结合。见表7。

图5 微小 RNA（miR）-125b-5p与p53 mRNA的3'端的非翻译区域的结合位点

表7 双荧光素酶报告实验验证miR-125b-5p与p53的靶向关系（相对荧光素酶活性）

3 讨论

AF是源自异常心房基质的复杂过程，具有多种诱发因素，如糖尿病、缺血性心脏病、衰老、高血压、肥胖、阻塞性睡眠呼吸暂停、遗传因素等，其中HF是最常见的诱发因素，HF合并AF的生理过程涉及心肌的结构和离子变化[9]。分析HF合并AF的机制具有重要的意义。

miRNA是一种长度约为22个核苷酸长度的、高度保守的单链RNA，其可与mRNA的3'端的非翻译区域基于碱基互补配对的原理结合，并在转录后的水平上导致mRNA的降解或者翻译抑制[10]。近年来，越来越多的研究发现miRNA在HF和AF的发生和进展中发挥关键作用，如miR-665过表达通过抑制PTEN的表达加重了主动脉狭窄诱导的心脏功能障碍[11]。miR-324-3p通过靶向AF中的 TGF-β1调节成纤维细胞增殖[12]。贾成林等[13]研究发现miR-499参与AF的发生。也有研究显示miR-21与心房功能障碍的超声心动图参数相关，可作为预测AF的标志物[14]。miR-125是一种新发现的具有心脏保护作用的miRNA，研究显示miR-125b-5p的降低会加剧急性心肌梗死引起的心肌损伤，而过表达miR-125b-5p可以抑制心肌损伤[15]。为分析miR-125b-5p在HF合并AF中的作用，本研究通过射频消融诱导HF，并通过程序性电刺激诱导AF，将LVEF＜45%合并AF的大鼠作为研究对象，通过尾静脉注射miR-125b-5p mimic来提高心肌细胞中miR-125b-5p水平，结果显示HF合并AF大鼠的心肌组织中miR-125b-5p水平明显降低，而提高miR-125b-5p水平显著缓解新心肌组织的损伤和心肌细胞的凋亡，并提高了心脏的射血功能，降低AF诱导率和诱导时间。心肌细胞的凋亡是导致HF和诱发AF的重要机制，有研究表明miR-125b-5p通过靶向Ras关联域家族 1蛋白的表达抑制了梗死诱导的心肌细胞凋亡[16]。根据文献报道和本研究结果，发现HF合并AF的心肌组织中miR-125b-5p水平降低，并且提高miR-125b-5p的水平能够抑制心肌细胞凋亡，并缓解HF和AF症状，提高心功能。

为进一步分析miR-125b-5p的心脏保护作用机制，笔者检测了心肌组织中凋亡相关PDCD4和p53蛋白的表达。凋亡引起的心肌细胞丢失不但会直接影响心脏收缩功能参与HF，也会直接影响电信号的传递导致心律失常引起AF[17-18]。PDCD4和p53均是调节细胞凋亡的关键蛋白，有研究发现miR-125b-5p可通过靶向抑制p53蛋白的表达抑制心肌细胞凋亡，从而缓解急性心肌梗死[19]。Luo等[20]究结果也显示提高miR-125b-5p水平会通过靶向抑制PDCD4和p53蛋白表达水平抑制心肌细胞凋亡，并缓解缺氧/复氧引起的心脏损伤。本研究结果表明HF合并AF大鼠的心肌组织中的PDCD4和p53蛋白水平均明显升高，而提高miR-125b-5p水平会抑制PDCD4和p53蛋白水平。此外，在心肌细胞中，也验证了miR-125b-5p能够靶向PDCD4和p53。结果文献和本研究结果均提示在心肌细胞中，miR-125b-5p能够靶向抑制PDCD4和p53蛋白水平来抑制心肌细胞的凋亡。

综上所述，miR-125b-5p通过抑制PDCD4和p53蛋白抑制心肌细胞的凋亡，从而缓解HF和并AF。关于miR-125b-5p在HF合并AF中的作用仍需要临床研究证实。