叶面喷施炭吸附聚谷氨酸对玉米生长发育的影响

曹丽茹 鲁晓民 王国瑞 党 尊 邱 天邱建军 田云峰 王振华 党永富

（1河南远东生物工程有限公司，466000，河南周口；2河南省农业科学院粮食作物研究所，450002，河南郑州；3河南省农业科学院科研管理处，450002，河南郑州）

玉米是重要的粮饲兼用作物和工业原料。21世纪初，全球玉米产量超过水稻和小麦，位居三大粮食作物之首[1]，每年种植面积达4000万hm2[2]。在玉米生长发育的过程中，常因极端气候[3-4]、病虫害[5]和种植密度[6]等环境因素，影响玉米的品质和产量。随着深加工技术的发展和再生能源的兴起，作为能源原料的玉米需求量日益增加，故在恶劣环境及现有技术条件下，保障稳产高产是玉米生产的重中之重[7]。

通过现代生物学技术改善作物品质、提高产量已经在农业、林业、园艺等领域广泛应用[8-9]。研究[10]发现，叶面喷锌可以提高玉米过氧化氢酶活性，增加产量；叶面喷施光碳核肥可以提高水稻的品质与产量[11]；玉米喷施多效唑，通过提高叶片光合作用的强度来提高产量[12]；玉米喷施油菜素内酯，增强了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）的活性，从而提高了叶片的光合作用强度[13]；矮壮素通过增强叶片的抗氧化酶活性来提高玉米的抗衰老功效[14]。通过叶面喷施水溶肥，植物能快速吸收所需要的养分，增强抗逆性，提高产量。聚谷氨酸在农业上的应用研究得到广泛的关注及探索，其常用作保水剂、肥料增效剂和肥料来使用[15]。研究[16-18]发现，聚谷氨酸可以提高经济作物对矿物质元素的吸收，增强植物的抗性和光合作用，同时可提高作物产量。炭吸附聚谷氨酸是在聚谷氨酸基础上经过生物炭处理而得到的新型材料，具有良好的水溶性、吸水性和缓解性，对环境安全友好。研究[19]表明，连续使用炭吸附聚谷氨酸水溶肥可提高土壤有机质含量；白菜喷施炭吸附聚谷氨酸水溶肥提高了土壤速效磷和速效钾的含量[20]；玉米 6～9叶期喷施炭吸附聚谷氨酸水溶肥可显著提高玉米的穗粒数和千粒重[21]。但关于炭吸附聚谷氨酸水溶肥对玉米生理生化方面的影响尚未见报道。

本文以郑单958和郑单1868为材料，在拔节期喷施炭吸附聚谷氨酸水溶肥（下面简称炭吸附聚谷氨酸），15d后测定叶片的叶绿素含量、净光合速率（Pn）、二磷酸核酮糖加氧酶（Rubisco）活性、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）、气孔密度、气孔张开程度、抗氧化酶活性、渗透调节物质含量及关键酶基因的相对表达量，同时分析玉米植株的养分吸收能力、籽粒鲜重和产量，分析炭吸附聚谷氨酸对玉米生理生化及产量的影响，为玉米高产栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试玉米（Zea maysL.）品种郑单 958（ZD958）和郑单 1868（ZD1868）均由河南省农业科学院粮食作物研究所玉米遗传育种室提供。供试炭吸附聚谷氨酸水溶肥由河南远东生物工程有限公司生产和提供，其主要成分包括有机质（≥80.0g/L）、聚谷氨酸（≥10.0g/L）和水不溶物（≤10.0g/L）。

1.2 试验方法

于2020年在河南省现代农业研究开发基地进行试验，供试地块地势平坦，土壤肥力中等。耕作层（0～20cm）土壤含氮100.95mg/kg、有效磷28.1mg/kg、速效钾143mg/kg、有机质30.1g/kg，pH 7.25。采用小区随机排列种植，玉米拔节期（第9叶完全展开）喷施炭吸附聚谷氨酸（炭吸附聚谷氨酸3.75kg/hm2+水 450kg/hm2，T），同时喷施清水作为对照处理（CK），从播种到收获期间的管理与田间正常管理一致。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 叶绿素含量 喷施炭吸附聚谷氨酸15d后，取穗部完全展开的叶片0.50g，加入80%丙酮10mL进行研磨，离心后取上清液1mL分别在663、645和470nm的波长下测其OD值，用80%丙酮作对照，计算叶绿素含量[22]。

1.3.2 光合相关参数及气孔情况 在上午 9:00-12:00使用LI-6400便携式光合仪测定穗部完全展开叶的Pn、Gs和Tr。叶片的水分利用率（WUE）=Pn/Tr，重复3次，取平均值。

取测定光合作用的叶片1～3mm2（不含叶脉），用磷酸盐缓冲生理盐水轻轻漂洗后，放入戊二醛电镜固定液中室温固定 2h；使用磷酸缓冲液（0.1mol/L、pH 7.4）漂洗3次，每次15min；叶片依次放入 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%的酒精中，每次15min，再放入乙酸异戊酯中15min；将样本紧贴于导电碳膜双面胶上，放入离子溅射仪样品台进行喷金约 30s；在扫描电子显微镜（HITACHI-SU8100）下观察不同视野中气孔的数目和张开程度，并拍照。

1.3.3 酶活性和脯氨酸含量 采用植物酶联免疫分析试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司生产）测定Rubisco活性。采用抗坏血酸氧化脱氢显色原理进行比色测定抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性；在邹琦[23]方法的基础上，利用光化学还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性[24]；采用磺基水杨酸提取―茚三酮显色法测定游离脯氨酸（Pro）含量[25]。

1.3.4 实时荧光定量PCR 使用Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取总RNA。以CK和T处理下郑单958和郑单1868的cDNA作为基因扩增的模板，选取与抗氧化物酶活性和Pro合成相关的基因设计引物（表1），以玉米18S基因作为内参，使用TaKaRa的TB GreenTM Premix EX TaqTM II（Tli RNaseH Plus）试剂盒，进行实时荧光定量PCR反应。采用2–∆∆Ct法计算基因相对表达量。

表1 引物名称与序列Table 1 Names and sequences of primers

1.3.5 玉米植株营养元素吸收和产量相关指标用H2SO4-H2O2消煮，采用奈氏比色法测定N元素含量，采用钼锑抗比色法测定P元素含量，采用火焰光度计法测定K元素含量[26]。

授粉后第17天开始取样，之后每隔9d取1次样，整个生长过程共取4次样（分别在授粉后17、26、35和44d）。取样时每小区选取有代表性植株6株，去皮称果穗，记为穗鲜重，剥取玉米穗中部正常籽粒100粒，迅速称重，记为百粒鲜重。成熟期玉米地上部分放入烘箱，在105℃杀青30min后，于80℃烘干至恒重后称干重。

玉米成熟期考种测产，各小区随机选取 50穗玉米，记录穗行数和行粒数，并计算籽粒鲜产量，产量（kg/hm2）=（每公顷穗数×穗行数×行粒数×单粒粒重）/1000。

1.4 数据处理

数据均取3次重复的平均值，采用SPSS 22软件进行方差分析和关联分析，各项生理生化指标和基因表达水平进行差异显著性检验，用Duncan’s新复极差法进行多重比较（P＜0.05），利用Microsoft Excel做柱形图。

2 结果与分析

2.1 喷施炭吸附聚谷氨酸对玉米长势及干重的影响

由图1可知，拔节期喷施炭吸附聚谷氨酸后的2个品种长势均较为旺盛，叶片全展开，叶面积较大，利于光合作用，茎秆较粗，可提高抗倒伏性。图2显示，与CK处理相比，T处理促进了玉米单株干重的增加，其中ZD958的单株干重增加了25.80%，ZD1868增加了26.25%，均达到了极显著差异水平。结果说明炭吸附聚谷氨酸显著提高了玉米的生物量，促进了玉米的生长发育。同时发现，ZD1868的干物质含量在喷施炭吸附聚谷氨酸前后均比ZD958的干物质含量多，推测可能是 ZD1868和ZD958品种间存在遗传差异的原因。

图1 炭吸附聚谷氨酸对玉米生长发育的影响Fig.1 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on the growth and development of maize

图2 炭吸附聚谷氨酸对玉米干重的影响Fig.2 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on dry weight of maize

2.2 炭吸附聚谷氨酸对玉米叶片叶绿素含量的影响

由图3可知，喷施炭吸附聚谷氨酸后，极显著提高了2个品种的叶绿素含量。与CK处理相比，ZD958叶绿素含量提高了 17.74%，ZD1868提高了 23.67%。CK处理 ZD1868的叶绿素含量高于ZD958，说明CK处理下ZD1868的光合能力亦强于ZD958。

图3 炭吸附聚谷氨酸对玉米叶片叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on chlorophyll contents of maize leaves

2.3 炭吸附聚谷氨酸对玉米光合作用的影响

图4显示，喷施后2个品种的Pn均极显著提高，其中 ZD958提高了 23.88%，ZD1868提高了25.25%，说明炭吸附聚谷氨酸对ZD1868的光合作用强度影响较大。图4显示，喷施炭吸附聚谷氨酸后叶片的Gs和Tr均有所增大，但未达到显著差异水平，ZD1868和ZD958的水分利用率则显著提高。喷施炭吸附聚谷氨酸后，ZD958和 ZD1868的Rubisco活性分别提高了3.20%和3.04%（图4）。同时发现，2个处理下，ZD1868的Pn、Gs及Tr均大于ZD958。

图4 炭吸附聚谷氨酸对玉米叶片光合作用的影响Fig.4 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on photosynthesis of maize leaves

以上结果表明，炭吸附聚谷氨酸促进Gs的增大，使玉米叶片能更好地吸收炭吸附聚谷氨酸的成分，从而提高了Rubisco的活性，最终增强光合作用。

2.4 炭吸附聚谷氨酸对叶片气孔密度和张开程度的影响

与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868的气孔密度无显著变化，气孔的长度和密度也没有明显的差异（图5，表2），表明炭吸附聚谷氨酸不影响玉米气孔的发育。与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868的气孔张开程度变化较大，其中ZD958叶片中完全张开和半张开气孔数目分别增加了80.50%和16.28%。ZD1868叶片中完全张开和半张开气孔数目分别增加了38.70%和26.67%。2个品种的完全闭合气孔数目较少，在50.00%以下（图6）。该结果与上述喷施炭吸附聚谷氨酸后光合作用强度显著提高的结果一致。同时发现，喷施炭吸附聚谷氨酸前后，ZD1868的气孔张开程度均高于ZD958气孔的开放程度。

图5 炭吸附聚谷氨酸对玉米叶片气孔形态的影响Fig.5 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on stomata shape of maize leaves

表2 炭吸附聚谷氨酸对玉米叶片气孔密度和大小的影响Table 2 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on stomata density and size of maize leaves

图6 炭吸附聚谷氨酸对玉米叶片气孔张开程度的影响Fig.6 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on stomata opening degree of maize leaf

2.5 炭吸附聚谷氨酸对抗氧化物酶活性及相关基因表达的影响

由图7a～c可知，与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868的SOD、POD和APX活性均极显著提高。其中，ZD958和ZD1868的SOD活性分别提高了 9.37%和 12.30%，POD活性分别提高了15.54%和17.87%，APX活性分别提高了84.14%和109.80%。结果说明炭吸附聚谷氨酸提高了玉米叶片的抗氧化酶活性，尤其对APX活性影响较大。

图7 炭吸附聚谷氨酸对玉米叶片抗氧化物酶活性及相关基因表达的影响Fig.7 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on antioxidant enzyme activities and related genes expression of maize leaf

通过实时荧光定量 PCR进一步对关键基因表达量进行分析，结果如图7d～f所示，与CK处理相比，喷施炭吸附聚谷氨酸后，合成这3种酶的基因ZmSOD、ZmPOD和ZmAPX在ZD958和ZD1868中的表达量极显著升高。抗氧化酶活性增强和相关基因表达量升高表明炭吸附聚谷氨酸启动了玉米体内清除活性氧有害自由基的系统。

2.6 炭吸附聚谷氨酸对渗透调节物质Pro相关基因表达的影响

由图8a可知，与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868的Pro含量分别提高了50.16%和49.42%，均达到极显著水平。对合成脯氨酸关键酶基因ZmP5CR的表达量进行分析，如图8b所示，与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868中ZmP5CR的表达量分别提高了41.80%和80.00%，表明炭吸附聚谷氨酸促进了玉米叶片Pro的合成。

图8 炭吸附聚谷氨酸对Pro含量及相关基因表达的影响Fig.8 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on Pro content and related gene expression of maize leaves

2.7 炭吸附聚谷氨酸对玉米植株营养元素的影响

由表3可知，与CK处理相比，T处理显著或极显著地提高了ZD958和ZD1868的N、P和K元素含量，其中ZD958的N、P和K含量分别提高了25.14%、27.57%和19.42%，ZD1868分别提高了26.87%、26.82%和16.22%，且ZD1868的营养元素含量要高于同条件下ZD958的营养元素含量。

表3 炭吸附聚谷氨酸对玉米植株营养元素的影响Table 3 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on mineral elements in maize plants mg/kg

2.8 炭吸附聚谷氨酸对玉米百粒鲜重及产量的影响

由图9a可知，随着授粉时间的增加，ZD958和ZD1868的百粒鲜重逐渐增加，授粉47d时达到最大值。在授粉15、25、33和47d时，T处理下ZD958的百粒鲜重分别比CK处理的增加了6.40%、9.20%、11.38%和 6.87%，ZD1868分别比 CK处理增加了8.80%、10.20%、7.22%和7.10%。2个处理下对应的每个阶段ZD1868的百粒鲜重均比ZD958的高。结果表明，炭吸附聚谷氨酸可提高玉米百粒鲜重，并且ZD1868的百粒鲜重比ZD958高。

图9 炭吸附聚谷氨酸对玉米百粒鲜重及产量的影响Fig.9 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on 100-seed fresh weight and yield of maize

由图9b可知，与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868的产量极显著提高，ZD958和ZD1868分别提高了11.01%和12.00%。同一个处理下ZD1868产量均比ZD958产量高。结果表明，炭吸附聚谷氨酸可提高玉米产量，并且ZD1868的产量比ZD958高。

2.9 玉米光合性能、渗透调节、养分吸收等指标与产量的灰色关联分析

玉米光合性能、渗透调节和养分吸收等指标与产量的量纲化不一致，首先对所有原始数据进行无量纲化处理，设产量为母序列，设其他指标X1～X15为子序列，对各指标数值进行标准化。对标准化后的数据进行关联度分析。由表4可知，光合作用和百粒重与产量的相关度高达0.95和0.94。其他指标与产量的关联度也较高（≥0.3297），依次是WUE、Rubisco活性、完全张开气孔数目、完全闭合气孔数目、Gs、叶绿素含量、Tr、半张开气孔数目、SOD活性、Pro含量、POD活性、气孔密度和APX活性。结果表明，光合作用相关参数与产量密切相关，膜系统相关参数与产量间接相关。

表4 光合作用和膜系统相关性状与产量的关联度及关联序Table 4 Correlation degree and correlation order between photosynthesis and membrane system related traits and yield

3 讨论

目前，现代生物学技术在玉米生产上主要通过调控光合强度、抗氧化活性、增加穗粒数等性状来提高玉米的品质和产量[27]。炭吸附聚谷氨酸是一种含有高分子有机质的生物材料。叶片喷施炭吸附聚谷氨酸后，所含有的高分子生物材料通过表面吸附作用传输于玉米叶片，然后运输到玉米的其他器官。

光合作用是植物在可见光的照射下，利用光合色素，将光能转换为化学能，是植物赖以生存的基础。其中叶绿素是最重要的光合色素之一，Rubisco是光合作用中固定CO2的关键酶之一。有试验[28]表明，外源NO能提高Rubisco活性，增强CO2的同化效率和光合电子传递效率，增加 RuBP固定CO2的能力。本研究表明，与CK处理相比，T处理下 ZD958和 ZD1868的叶绿素含量分别极显著提高了17.74%和23.67%（图3）；同时极显著提高了ZD1868和ZD958的Rubisco活性（图4e）；与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868的Pn分别极显著提高了23.88%和25.25%，Gs和Tr均有所增大，但ZD1868和ZD958的水分利用率仍然极显著提高。结果说明炭吸附聚谷氨酸通过促进气孔张开，一方面使玉米叶片能更好地吸收炭吸附聚谷氨酸含有的高分子有机物质，另一方面增加气体交换，提高Rubisco活性，从而增强玉米叶片的光合作用和水分利用率。外源喷施化控试剂“五谷丰”增强玉米的叶绿素含量，提高叶片的Pn，增强了叶片的光合能力，延缓了叶片衰老[29]。外源喷施化控试剂“玉黄金”同样提高了玉米的叶绿素含量、Pn、最大光化学效率Fv/Fm和实际量子产量Y（Ⅱ）[30]。本文所用的炭吸附聚谷氨酸水溶肥提高了叶绿素含量和Pn，促进了玉米叶片的光合能力，与“五谷丰”和“玉黄金”具有类似的作用。张浩等[31]证实，气孔张开可增加内外气体的交换，利于植株光合作用。本研究利用扫描电镜观察叶片气孔，与CK处理相比，T处理不影响ZD958和ZD1868气孔密度，但增加了完全张开和半张开气孔数目，而完全闭合气孔数目极显著降低。该结果与上述喷施炭吸附聚谷氨酸后光合作用强度极显著提高的结果一致。

SOD、POD和APX是植物组织清除O2、-OH和 H2O2来减少活性氧的关键酶，可减轻对叶绿体细胞膜的伤害，保护细胞膜系统[32]。本研究结果表明，与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868的SOD活性分别提高了9.37%和12.3%，POD活性分别提高了15.54%和17.87%，APX活性分别提高了84.14%和109.8%；合成这3种酶的基因ZmSOD、ZmPOD和ZmAPX在ZD958和ZD1868中的表达量极显著升高。生理指标和响应基因表达模式的分析证实炭吸附聚谷氨酸提高了玉米叶片的抗氧化酶活性，启动了玉米体内活性氧清除系统，保护细胞膜，尤其是对APX活性影响较大。Pro是重要的渗透调节物之一，它的积累可降低细胞的渗透势，使细胞吸收更多的水分以维持细胞正常的膨压，从而保护细胞膜[33]。∆1-二氢吡咯-5-羧酸还原酶（P5CR）是催化∆1-二氢吡咯-5-羧酸（P5C）合成Pro的关键酶之一，前人研究[34]证实，编码P5CR的转基因株系中Pro含量提高，且耐旱和抗盐等非生物胁迫能力显著提高。本研究表明，与CK处理相比，T处理下ZD958和ZD1868的Pro含量分别极显著提高了50.16%和49.42%，同时ZmP5CR基因在ZD958和ZD1868中表达量均显著升高。炭吸附聚谷氨酸通过提高玉米抗氧化酶活性和促进Pro的积累来保护细胞膜和提高细胞吸水及保水能力。

本研究结果表明，与CK处理相比，T处理显著提高了ZD958和ZD1868的N、P和K营养元素的含量和产量，明显提高了百粒鲜重。说明喷施炭吸附聚谷氨酸可提高玉米植株营养元素的运输与储存能力，改善玉米器官的光合能力，使得叶片产生较多的光合产物运输到库器官，提高了玉米籽粒鲜重。玉米产量的高低与籽粒重密切相关，增加籽粒重是提高产量的关键因素。

综上所述，炭吸附聚谷氨酸可能通过提高玉米叶片的叶绿素含量，并促进叶片气孔的张开程度，从而提高光合性能，增加对太阳能的固定，同时提高对N、P和K营养元素的吸收能力，调控玉米体内同化物质的运输和分配，促进玉米干物质的增加，提高产量。同时提高渗透调节物质和抗氧化酶相关基因的表达，积累渗透调节物质、提高抗氧化酶活性，更好地保障玉米的生长发育，该结果与前人研究[35]较为一致。ZD1868的生理指标、营养元素及生长状况在同等条件下均优于 ZD958，而且ZD1868的百粒鲜重和产量均明显大于ZD958，推测造成该现象的主要原因之一是品种间存在遗传差异。

影响产量及相关性状的因素很多，目前的报道主要集中在穗部性状。魏湜等[36]研究表明，穗长是影响玉米产量的最关键因素，百粒重次之，随后是行粒数和穗粗。郭金生等[37]研究表明，灰色关联分析可有效评价影响因子与主效因子之间的相关性。本研究利用灰色关联分析法，探究玉米叶片生理生化指标与产量的相关性，发现光合作用和百粒重与产量的相关度高达0.953和0.943，然后依次是水分利用率、Rubisco、完全张开气孔、完全闭合气孔数目、Gs、叶绿素含量、Tr、半张开气孔数目、SOD活性、Pro含量、POD活性、气孔密度和APX活性。该研究结果为培育玉米高产新品种提供理论参考。

4 结论

叶面喷施炭吸附聚谷氨酸水溶肥，显著增强了郑单958和郑单1868的光合作用强度和水分利用率，提高了抗氧化酶POD、SOD、APX的活性、Pro含量及关键酶基因（ZmSOD、ZmPOD、ZmAPX和ZmP5CR）的相对表达量，提高了郑单958和郑单1868的氮、磷和钾含量和产量。该结果为生产上使用炭吸附聚谷氨酸提高玉米产量提供了理论依据，也为进一步深入研究炭吸附聚谷氨酸影响籽粒鲜重和产量的内在机理奠定了基础。由于调节剂存在专一性和时效性，要系统了解炭吸附聚谷氨酸对玉米生长发育的影响机制，今后将开展多年多点的试验鉴定，为炭吸附聚谷氨酸在玉米生产上的应用提供科学依据。