基于分子对接探究紫苏粗提物对代谢综合征相关酶的抑制作用

余雨婷 张 彦 张 迎 李娜娜 程 研 郑梦迪 闫 平 柴希艳

(1. 西安医学院，陕西 西安 710021；2. 南京中医药大学，江苏 南京 210023；3. 西安雨润百德健康管理有限公司，陕西 西安 710061)

紫苏(PerillafrutescensL. Britt.)为唇形科紫苏属植物。《中国药典》(2020版)记载，紫苏可用于风寒感冒、咳嗽呕恶、妊娠呕吐、鱼蟹中毒等[1]。其含有挥发油、黄酮、酚酸、花色苷等化学成分，具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗抑郁等作用[2]。

以肥胖、高血糖、高尿酸血症等为主的代谢综合征(MS)是多种代谢紊乱在体内“聚集”的一种病理状态，可增加糖尿病、心血管疾病等的发生风险，近年来已成为全球公共健康问题[3]。目前对MS的治疗均为对某一疾病的单一治疗，如降低血糖、血脂、血压水平[4]，尚缺少对MS的综合治疗。有效防治MS涉及多靶点调控[5-6]。胰脂肪酶是胰腺腺泡细胞分泌的消化脂肪的关键酶，抑制胰脂肪酶可降低肠道中脂肪的消化和分解，治疗肥胖[7]。黄嘌呤氧化酶(XOD)是尿酸生成的关键酶，在体内可催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，进一步氧化为尿酸[8-9]。该途径可切断尿酸生成，从而降低尿酸水平。α-淀粉酶是重要的碳水化合物水解酶，尤其对于中国2型糖尿病以碳水化合物为主要食物的患者，抑制α-淀粉酶的活性可减少餐后高血糖[10]。乙酰胆碱酯酶(AChE)是生物神经传导中的关键性酶，AChE抑制剂(AChEI)是当前阿尔茨海默症与中老年人痴呆最常见的疾病靶点[11]。

目前对紫苏的研究多集中于紫苏叶、紫苏籽粕[12]及紫苏籽油[13]的药用、油用、香料、食用等方面，但未见关于紫苏防治MS及多靶点抑制作用的研究。研究拟通过IC50值评价抑制活性，并采用分子对接验证结果及预测更多潜在靶点，旨在为紫苏作为食品添加剂预防和治疗代谢综合征的作用提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器

架盘药物天平：IYT-10型，上海光正医疗仪器有限公司；

数显控温电热套：SXKW型，北京市永光明医疗仪器厂；

电热恒温水浴锅：DZKW-D-2型，北京市永光明医疗仪器厂；

超声波清洗器：KQ-250B型，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发器：XD-52AA型，上海贤德实验仪器有限公司；

干燥箱：101-1 型，上海市实验仪器总厂；

紫外可见分光光度计：UV-1100 型，上海美谱达仪器有限公司；

高效液相色谱仪：Agilent 1260 LC型，美国安捷伦科技有限公司；

电子分析天平：SQP型，赛多利斯科学仪器北京有限公司；

砂芯过滤器：1 000 mL，上海申迪玻璃仪器有限公司；

酶标仪：ReadMax 1900/1900Plus型，上海闪谱生物科技有限公司。

1.2 试剂与试药

紫苏：2017—2019年采集于陕西西安、眉县和甘肃正宁，经西安医学院生药教研室汪兴军老师鉴定为唇形科植物紫苏PerillafrutescensL.Britt.；

无水乙醇：分析纯，利安隆博华天津医药化学有限公司；

没食子酸对照品：纯度≥99%，天津市光复精细化工厂；

芦丁、木犀草苷：HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司；

甲醇：色谱纯，广东光华科技有限公司；

黄嘌呤氧化酶：美国Sigma公司；

黄嘌呤：纯度≥95%，美国Sigma公司；

α-淀粉酶、3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)：西安姚北生物科技有限责任公司；

胰脂肪酶：上海阿拉丁生化科技有限责任公司；

对硝基苯丁酸酯(PNPP)：上海源叶生物科技有限公司；

N,N-二甲基甲酰胺、磷酸盐缓冲液(PBS)、乙酰胆碱酯酶、5, 5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、多奈哌齐：美国Sigma公司。

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1.3 分子对接软件及数据库

采用SYBYL-X2.1.1分子模拟软件(USA)、ChemDraw绘图软件；采用TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/)、RCSB(https://www.rcsb.org/pdb)和Pubchem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库。

1.4 方法

1.4.1 粗提物的制备 称取紫苏叶100 g，用60%乙醇回流提取两次，每次1 h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，置于水浴锅中浓缩得醇提物浸膏，50 ℃烘干得紫苏粗提物。

1.4.2 总酚酸含量测定 采用福林酚法[14]。

1.4.3 总黄酮含量测定 采用亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠比色法[15]。

1.4.4 木犀草苷含量测定 采用高效液相法，色谱条件：Agilent 5 HC C18250 mm×4.6 mm，柱温为室温，以甲醇—0.1%甲酸水(V甲醇∶V甲酸水为45∶55)为流动相，流速1.0 mL/min，波长360 nm。

1.4.5 体外α-淀粉酶活性抑制试验 参照文献[16-17]的方法并修改。精密称取1 gα-淀粉酶，用PBS缓冲液配置成0.02 g/mL溶液，待用。精密称1 g可溶性淀粉，先用少量沸水溶解，再定容至100 mL，煮沸至溶液澄清，取上清液备用。并按式(1)计算α-淀粉酶的抑制率。

(1)

式中：

RI——抑制率，%；

A1——空白组吸光度；

A2——空白对照组吸光度；

A3——抑制组吸光度；

A4——抑制对照组吸光度。

1.4.6 体外XOD活性抑制试验 称取30 mg黄嘌呤，加入2 mL氨水超声溶解，用磷酸钾缓冲液配制成0.1 mmol/L 的溶液，用时稀释至0.01 U/L。取5 U黄嘌呤氧化酶，配制成0.5 U/mL，用时稀释至0.1 U/mL，现配现用。以黄嘌呤为底物，通过酶标仪检测3种药材的XOD抑制活性。设置紫苏粗提物质量浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.30，0.40 mg/mL，设置空白组、空白对照组、抑制组和抑制对照组，每组总体积200 μL。将各样品和50 μL黄嘌呤(0.01 U/L)共孵育5 min。加入50 μL XOD(0.1 U/L)引发反应(XOD需在25 ℃预孵30 min以稳定酶活)，混匀，测定295 nm处吸光度，按式(1)计算XOD抑制率，并以别嘌醇片为阳性对照[18]。

1.4.7 胰脂肪酶活性抑制测定 参照Liang等[19]的方法并修改。称取0.05 g胰脂肪酶用缓冲液溶解定容至50 mL，8 000 r/min离心10 min，取上清液稀释得胰脂肪酶溶液。称取0.156 g PNPP，溶于0.25 mLN,N-二甲基甲酰胺，缓冲液定容得底物溶液。按式(1)计算PNPP抑制率。

1.4.8 乙酰胆碱酯酶活性抑制试验 将乙酰胆碱酯酶配置成1.2 mmol/L溶液待用，用时稀释10倍。称取ATCH 3.5 mg定容至10 mL。称取24 mg DTNB于10 mL 容量瓶。96孔板中每孔加入PBS 100 μL，乙酰胆碱酯酶(溶于pH 7.5 PBS中)20 μL，样品溶液20 μL，0.12 mmol/L ATCh 20 μL作为酶反应底物。37 ℃培养30 min，加入20 μL质量分数为4%的SDS终止反应，加入0.6 mmol/L DTNB 20 μL，测定405 nm处吸光度，按式(2)计算乙酰胆碱酯酶抑制率，并以多奈哌齐为阳性药。

R=[1-(A样品-A背景)/A空白]×100%，

(2)

式中：

R——乙酰胆碱酯酶抑制率，%；

A样品——加入样品的反应体系的吸光度；

A背景——以PBS(pH 7.5)代替酶液的反应体系的吸光度；

A空白——以样品溶剂代替样品的反应体系的吸光度。

1.4.9 分子对接预测作用机制与靶点

(1) 小分子结构：将化合物3D结构导入SYBYL-X2.1.1中生成表单，再分别放入摩尔区进行能量最小化和加电荷处理，将处理好的结构保存至database数据库中，以备后续对接。

(2) 蛋白质结构：从RCSB蛋白质数据库中下载胰脂肪酶和α-淀粉酶的靶点蛋白晶体结构，利用SYBYL-X2.0软件中的Surflex-Dock模块对其进行结构处理，用于设定对接口袋。

(3) Surflex-Dock对接及评分标准：Surflex-Dock用于分子对接，Cscore用于评价结合打分的一致性，配体模式用于对接小分子化合物到受体的结合部位，小分子配体与相关蛋白的亲和力打分用于评价其结合力，亲和力打分越高，结合力越强、结合活性越高。用Total-Score打分函数对小分子与靶标相互作用进行评分，Total-Score函数综合考虑了极性作用、疏水作用、焓和溶剂化等因素，该值愈大，对接复合物越稳定，小分子化合物与大分子蛋白质的匹配结合作用越好。Total-Score等于8为阈值，8分以上为匹配结合作用良好。

1.4.10 试验数据处理 使用Origin 8.5软件进行数据处理和作图，采用SPSS Statistics 23.0软件计算IC50值。

2 结果与分析

2.1 样品提取率

紫苏叶醇提取后最终得到干燥品18.59 g，提取率为18.59%。

2.2 总酚酸含量

没食子酸标准曲线方程为y=5.453 0x+0.375 9，R2=0.975 4，吸光度与浓度呈良好的线性关系。试验测得紫苏粗提取物中总酚酸含量为58.59 mg/g。

2.3 总黄酮含量

芦丁标准曲线方程为y=4.821 8x-0.003 8，R2=0.995 5，吸光度与浓度线性关系良好，试验测得紫苏粗提物中黄酮含量为0.309 8 mg/mg。

2.4 木犀草苷含量

木犀草苷标品及样品的色谱图见图1，木犀草苷保留时间为8.236，峰面积为106.9。采用外标法测得样品中木犀草苷含量为0.819 4 mg/g。

图1 标准品和样品的色谱图Figure 1 Chromatography of the standards and samples

试验发现，木犀草苷标准品的进样量与峰面积的积分值的线性方程为Y=19.772X-3.85，R2=0.999 2，当木犀草苷质量浓度为38～152 mg/mL时线性关系良好。精密度试验的RSD为0.36%，表明仪器的精密度良好。重复性试验的RSD为1.97%，表明该方法重复性较好。稳定性试验的RSD为1.52%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.5 紫苏粗提物对α-淀粉酶的抑制活性

由图2可知，紫苏粗提物对α-淀粉酶活性抑制作用的IC50值为0.273 mg/mL，表明紫苏粗提物对α-淀粉酶活性有一定的抑制作用，即紫苏中含有的活性成分能够抑制血糖水平，后续可对其进行进一步研究。

图2 紫苏粗提物对淀粉酶的抑制曲线Figure 2 Amylase inhibition curves of crude extracts of Perilla

2.6 紫苏粗提物对黄嘌呤氧化酶的抑制活性

由图3可知，紫苏粗提物和别嘌醇对黄嘌呤氧化酶活性抑制作用的IC50值分别为0.244，0.319 mg/mL。与阳性对照药别嘌醇相比，紫苏粗提物对黄嘌呤氧化酶有一定的抑制活性，说明紫苏中的活性成分可以降低尿酸水平。

图3 紫苏粗提物质量浓度与XOD酶抑制率的量效关系Figure 3 The dose-effect relationship between sample concentration and XOD enzyme inhibition rate

2.7 紫苏粗提物对胰脂肪酶的抑制活性

由图4可知，紫苏粗提物和奥利司他对胰脂肪酶活性抑制作用的IC50值分别为0.347，0.614 mg/mL。与阳性药奥利司他相比，紫苏粗提物有较好的抑制胰脂肪酶作用，表明紫苏粗提物可以降脂、治疗肥胖代谢综合征。

图4 紫苏粗提物对胰脂肪酶的抑制曲线Figure 4 Pancreatic lipase inhibition curves of the crude extracts

2.8 紫苏粗提物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性

由图5可知，紫苏粗提物对乙酰胆碱酯酶活性抑制作用的IC50值为0.018 mg/mL，说明紫苏粗提物对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，但相对阳性药多奈哌齐(0.008 mg/mL)较差，需对粗提物进行深入研究。

图5 紫苏粗提物对乙酰胆碱酯酶的抑制曲线Figure 5 Inhibition curve of Perilla on acetylcholinesterase

2.9 分子对接预测紫苏与胰脂肪酶和淀粉酶抑制作用靶点

将32种化合物与胰脂肪酶蛋白数据库中1lpa、1lpb、1n8s 3个靶标蛋白进行分子对接，共分子对接96次，将32种化合物与α-淀粉酶的一个靶标蛋白5u3a对接32次，对接最佳结果见表1～表3，其中，与1n8s对接无化合物打分>8。由表1～表3可知，芹菜素-5-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-二葡萄糖苷酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香苷、迷迭香酸、芦丁等为紫苏粗提物的有效活性成分。

表1 与胰脂肪酶1lpa对接最佳结果Table 1 Best results for docking with pancreatic lipase 1lpa

表2 与胰脂肪酶1lpb对接最佳结果Table 2 Best results for docking with pancreatic lipase 1lpb

表3 与α-淀粉酶5u3a对接最佳结果Table 3 Best results for docking with-amylase 5u3a

3 结论

探究了紫苏粗提物对α-淀粉酶、黄嘌呤氧化酶、胰脂肪酶、乙酰胆碱酯酶的体外抑制活性。结果表明，紫苏粗提物对4种酶均有抑制作用，表明紫苏粗提物可有效防治以肥胖、高血糖、高尿酸血症等为主的代谢综合征。但多靶点体外筛选模型仅为代谢综合征的治疗提供参考，后续将通过体内整体动物试验深入探究紫苏粗提物的降脂、降糖、降尿酸作用。