蛋白基植物多酚纳米输送载体研究进展

陈杨玲 焦 叶 崔 波 方 芳杨进洁 程云辉,

(1. 长沙理工大学食品与生物工程学院，湖南 长沙 410114；2. 齐鲁工业大学食品科学与工程学院，山东 济南 250353；3. 烟台双塔食品股份有限公司，山东 烟台 265404)

植物多酚是一类广泛存在于植物中的含有多个酚羟基的化合物，常见于蔬菜、水果、谷物、药草和香料中，以苯酚为骨架，以苯环的多羟基取代为特征，按结构可分为类黄酮、芪类、酚酸和木酚素[1](见图1)。植物多酚具有抗炎、抑菌、抗衰老和抗癌等功能，是天然色素的重要组成成分和抗氧化剂的主要来源，被广泛应用于食品和医药行业[2]。

图1 植物多酚化合物类型Figure 1 Examples of plant polyphenol compounds

许多植物多酚如姜黄素、白藜芦醇和黄酮类化合物等皆存在溶解度低的问题，因此加工性能不佳，也影响其在人体内的吸收。部分多酚如表没食子儿茶素没食子酸酯，虽然溶解度高，但细胞膜通透性差，极大地限制了其在肠道中的吸收，其生物利用度也低。此外，某些植物多酚在碱性、光、热等条件下不稳定，易受外界环境因素影响而发生降解。植物多酚体内低效输送和低生物利用度极大地限制了其在功能性食品和药物中的应用[3]。

20世纪末出现的纳米输送体系(nanodelivery)为植物多酚在生物体内的输送及其在环境中的有效保护提供了新的思路。纳米输送体系是通过将载体和植物多酚复合物体系减小到纳米范围来提高其表面积与体积比，从而有效提高植物多酚的生物利用度，并改善其溶解度和稳定性[4]。因蛋白质具有生物降解性、生物相容性和可再生性，且其结构上具有丰富的官能团和疏水结合位点，易与生物活性物质特别是疏水性生物活性物质结合，而基于蛋白质的纳米载体技术被认为是输送难溶性生物活性物质的最有前途和最有效的技术之一[5]，因而被广泛应用于植物多酚等生物活性物质的包埋[6]。

研究拟系统梳理近年来国内外有关纳米输送体系的制备方法，动物蛋白、植物蛋白以及蛋白酶解物在构建蛋白基植物多酚纳米输送体系中的应用，以及交联剂对蛋白基纳米输送载体包封率与稳定性提升的研究进展，以期为扩大植物多酚在食品和药品领域的应用提供理论参考。

1 纳米输送体系构建方法研究进展

纳米输送体系是指采用物理或化学方法制备、平均粒径为1～1 000 nm的药物或功能因子输送体系[3]。纳米输送载体可以保护生物活性物质免受不适当环境的影响，提高其在酸、碱、光、热等条件下的稳定性。此外，纳米输送体系还能提高难溶性化合物在水中的溶解度，控制生物活性物质在胃肠道的释放，增加人体对营养物质的吸收，提高生物活性物质的生物利用度[7]。纳米输送体系的构建方法主要分为由上而下(Top-Down)和由下而上(Bottom-Up)两种方式。

1.1 由上而下的构建方法

由上而下的构建方法是指运用机械手段(如均质、研磨等)，利用高速剪切器、高压均质机、胶体磨、微射流和超声等设备，将尺寸较大的颗粒或液滴破碎成小颗粒或小液滴，以降低颗粒或液滴的尺寸。该方法制备效率高，同时成本也比较高，但产生的液滴尺寸范围较广，所制备的纳米粒子稳定性较差，存在容易重新结晶形成不溶性大颗粒的问题。由上而下构建法常被应用于纳米乳液的制备中。

1.1.1 微流化 微流化是使用非常高的压力迫使液体通过由特殊配置的微通道组成的相互作用室。液体通过微通道后进入碰撞室，形成细小的纳米级液滴。Zhang等[8]将姜黄素和豌豆蛋白混合，通过微流化器制备豌豆蛋白—姜黄素纳米粒子，其粒径为357 nm。Luo等[9]利用双通道微流化制备乳清蛋白-β胡萝卜素纳米乳液，随着压力增大至131 MPa，粒径减少至136 nm，且纳米乳液在4，25，55 ℃下贮藏14 d，粒径未发生显著变化。

1.1.2 高压均质 高压均质是指当液体快速通过具有特殊内部结构的空腔时，受到高速剪切、高频振荡、空化效应和对流冲击等机械力的作用，在这些机械力的作用下，大液滴会被破碎成小液滴的过程。Zhou等[10]利用高压均质化将大豆分离蛋白纳米乳液的粒径降低到165 nm。Jin等[11]采用高压均质处理制备大豆蛋白水解物—葡聚糖—阿魏酸三元纳米复合物，其粒径为130 nm。高压均质处理后的纳米粒子，变性温度升高，而DPPH自由基清除能力比未处理的高约11%，表明高压均质处理提高了纳米粒子的热稳定性和抗氧化性。

1.1.3 超声 超声可以分解颗粒和聚合物结构的聚集体，将尺寸减小到纳米级，空化气泡破裂产生的力可以将大液滴分解成较小的液滴。Zhang等[12]使用超声法制备藜麦蛋白纳米粒子，超声密度增加至10 kJ/mL时，粒径减小至132 nm且呈球形结构。同时，也有研究[13]将超声应用至水稻肽纳米粒子的制备，其粒径通过超声处理减小至357.8 nm。超声处理后的纳米粒子的抗氧化性比未超声前的高，其DPPH自由基清除能力增加3.5倍，亚铁离子螯合活性增加3.8倍。

1.2 由下而上的构建方法

由下而上法是利用物理或化学方法将材料从分子尺度组装到纳米甚至是宏观尺度，包括反溶剂法、热凝胶诱导、pH偏移法等，这些方法都是通过改变制备条件使得所用材料发生沉淀的过程[14]。由下而上构建法成本低，无需大型设备，技术操作更为简单，产生的液滴尺寸均匀，但存在耗时长、效率低的局限性。

1.2.1 反溶剂法 反溶剂法是通过在溶剂中加入反溶剂，使得溶质溶解度下降而聚集形成颗粒的方法。对于醇溶蛋白，制备纳米输送体系时，可将多酚和醇溶蛋白一同溶解至有机相中，滴入作为反溶剂的水中；滴加过程中，乙醇分子在水相中迅速扩散，在醇溶蛋白周围的极性环境中出现大量含有疏水氨基酸的醇溶蛋白自发收缩聚集形成纳米颗粒。焦岩等[15]采用反溶剂法以玉米醇溶蛋白为载体包埋叶黄素，包封率为81%，制得的球形纳米粒子粒径为398.3 nm。Salah等[16]通过反溶剂法制备β-乳球蛋白—花青素纳米粒子，粒径为172～199 nm。DSC谱图显示β-乳球蛋白—花青素纳米粒子的吸热峰升高至150 ℃，具有良好的热稳定性；被包埋后花青素的生物利用度从8%提高至22%。

1.2.2 pH偏移法 pH偏移法是指将溶液体系pH值从中性调至极酸或极碱，诱导蛋白结构发生变化并与生物活性物质结合，再将pH调至中性而促使纳米粒子形成的方法。其操作简单，不引入有机试剂，但是部分植物多酚在强碱性条件下会发生降解。Tian等[17]将β-伴大豆球蛋白溶液的pH调至12，加入橙皮素和橙皮苷粉末后，搅拌一定时间再调至中性，离心得到上清液即为β-伴大豆球蛋白橙皮素/橙皮苷纳米复合物，粒径均在60 nm以下。pH的改变有助于促进β-伴大豆球蛋白疏水基团暴露，从而与橙皮素中的苯环和橙皮苷中的糖苷发生疏水相互作用。Du等[18]采用pH偏移法利用山羊奶酪蛋白肽包埋姜黄素，得到104.6 nm的球形纳米粒子，有效提高了姜黄素的稳定性。纳米粒子在4，25 ℃下贮藏15 d后，保留率比游离姜黄素分别高约75%，55%。37，50，70，90 ℃ 下孵育40 min后，纳米粒子保留率均显著高于游离姜黄素。

1.2.3 热诱导凝胶法 当加热温度高于蛋白质变性起始温度时，蛋白质的结构逐渐展开致使其内部的疏水基团暴露，此时分子间疏水相互作用促使蛋白质聚集甚至凝胶化，在聚集过程中可与植物多酚发生相互作用，即热诱导凝胶法。Du等[19]将大豆分离蛋白于95 ℃加热15 min后冷却，加入溶于乙醇的姜黄素，反应后旋蒸除去乙醇，获得粒径为118 nm的纳米粒子。Brunna等[20]将β-乳球蛋白于100 ℃加热60 min并加入50 mmol/L的NaCl溶液中，该体系具有最优的泡沫稳定性和乳液稳定性，且对槲皮素、芦丁、柚皮苷和维生素B2均有良好的包埋效果，包封率分别为96.50%，89.04%，67.78%，36.39%。

2 蛋白基植物多酚纳米载体研究进展

2.1 动物蛋白基植物多酚纳米载体

2.1.1 酪蛋白 酪蛋白是牛奶中的主要蛋白，包含αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白4种组分。在溶液中，酪蛋白以多个单体聚集而成的胶束形式存在，主要通过非共价相互作用来维持。这些非共价相互作用可以通过物理化学处理消除，包括改变pH值、加热、高压或超声处理等。在适当的条件下，解离的酪蛋白可以重新组装形成与天然酪蛋白胶束相似的结构。解离和重构是利用酪蛋白胶束作为疏水性生物活性物质的纳米载体的有效方法。吴雪娇等[21]利用酪蛋白与麦芽糊精进行自组装，两者通过次级力形成较弱的复合物，使酪蛋白暴露了更多的亲水基团，在pH为7时反应25 h，溶解度显著提高至约90%。酪蛋白—麦芽糊精纳米复合物对原花青素的包封率达到93%，并呈光滑紧凑的球状结构，平均粒径为158.69 nm。另外，酪蛋白酸盐，如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙等，在适当的条件下也可以自组装形成胶束状结构，可以作为植物多酚的纳米载体[22]。

2.1.2 乳清蛋白 乳清蛋白是从乳清中得到的球状蛋白质，约占牛乳总蛋白的20%，主要由β-乳球蛋白和α-乳白蛋白组成，并含有少量乳铁蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白、糖巨肽、酶和生长因子，含有人体所有的必需氨基酸，营养价值高，易消化吸收。乳清蛋白在组装成纳米结构前需变性或破坏，使乳清蛋白的结构展开或解离从而荷载生物活性物质。钱柳等[23]将乳清蛋白经热处理后，包埋矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)。在模拟胃肠液消化4 h后，乳清蛋白-C3G纳米粒子对C3G的保留率比游离C3G提高22%，有效改善了C3G的胃肠消化稳定性。乳清蛋白-C3G纳米粒子在模拟胃、肠液中的释放率分别为18%，87%，表明乳清蛋白-C3G纳米粒子可以控制C3G在肠道释放并发挥功能作用。

β-乳球蛋白约占乳清蛋白总量的50%，含有由8条反向折叠的多肽链形成的疏水空腔，该空腔是结合疏水性物质的重要位点。Xie等[24]研究了植物多酚与牛血清白蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白的相互作用，其中β-乳球蛋白具有最高的结合能力，可与单宁酸组成更加稳定的复合物。Salah等[25]以β-乳球蛋白制备纳米输送载体包埋花青素，DSC热谱图显示β-乳球蛋白—花青素纳米粒子吸热峰的出现比花青素高18 ℃，表明花青素的热稳定性得到提高，而且生物利用度从11.27%提高到19.23%。

利用乳清蛋白制备纳米输送载体时，其潜在致敏性也引起学者的关注。过敏主要由免疫球蛋白E(IgE)介导的反应引起，可导致各种临床症状，如腹泻和生长迟缓等。研究[26]发现，植物多酚与过敏蛋白的作用可能掩盖或改变 IgE位点或阻断 IgE位点结合。Xu等[27]研究表明，乳清蛋白—绿原酸结合物显示出比单独乳清蛋白更低的IgE结合能力。利用好植物多酚与乳清蛋白的相互作用既能减轻乳清蛋白的致敏性，又能充分发挥植物多酚的生理活性优势。

2.1.3 白蛋白 白蛋白是一种水溶性球状蛋白，富含二硫键，在一定条件下可通过分子间和分子内的二硫键—巯基交换反应进行自组装，而且其表面载有大量活性基团可被用来结合配体和进行其他的功能性修饰。白蛋白在药物输送方面已经取得一些成效，但因其成本较高，在食品中的应用较少。牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)是制备药物纳米输送载体的常用材料。BSA是一种从牛血清中获得的水溶性蛋白质，与HSA具有高度相似性[28]。研究[29]表明，负载姜黄素的BSA蛋白纳米粒子呈球形，粒径为92 nm，包封率为78%，纳米粒子溶血活性低，具有生物相容性。Desale等[30]采用BSA对紫杉醇进行包埋，可使紫杉醇的生物利用度提高2.5倍。与其他纳米输送载体相比，HSA具有非免疫源性的优势，基本不会与人体产生免疫反应[31]。Yuan等[32]制备了槲皮素—人血清白蛋白(HSA)纳米复合物，包封率为68.99%，槲皮素-HSA纳米复合物可减弱H2O2对细胞的伤害，对受损细胞的修复程度比游离槲皮素高19%。

2.2 植物蛋白基植物多酚纳米载体

2.2.1 玉米醇溶蛋白 玉米醇溶蛋白是玉米中主要的贮藏蛋白，其表面含有超过50%的疏水性氨基酸残基，使玉米醇溶蛋白难溶于水，其良好的两亲性和自组装特性使之被广泛应用于纳米输送载体的植物蛋白中。周浓等[33]以玉米醇溶蛋白负载番石榴黄酮，得到粒径为500 nm的球形纳米粒子，制备的纳米粒子能有效抑制H2O2诱导HepG2细胞产生的氧化损伤。Zou等[34]将槲皮素包埋于玉米醇溶蛋白中，制得粒径约为150 nm的球形纳米粒子，包封率为76%。玉米醇溶蛋白—槲皮素纳米粒子在pH 2～8、90 ℃加热2 h和NaCl浓度为0～2 mol/L下均能保持良好的稳定性，且其对ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力均高于游离槲皮素。与游离槲皮素相比，玉米醇溶蛋白—槲皮素纳米粒子有更显著的活性氧(ROS)清除能力。

2.2.2 大豆蛋白 大豆蛋白来源广泛、资源丰富，主要分为大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，在高温、pH或离子强度等外部环境变化时，大豆蛋白亚基之间的非共价相互作用被破坏，会形成新形态的聚集体，这种形态变化有利于对生物活性物质进行封装。植物多酚被封装在大豆蛋白结构中，不仅水溶性、稳定性和生物利用度提高，且在某些情况下能在肠道进行持续释放。Wang等[35]利用大豆分离蛋白作为纳米输送载体开发了新型姜黄素纳米输送体系，获得包封率(88%)较高的纳米粒子。在模拟肠液中释放率为81%，远高于模拟胃液中的(37.9%)，可保护姜黄素在肠道进行缓慢释放；该纳米粒子在pH 3～9、温度30～90 ℃和盐浓度0～40 mmol/L下均表现出良好的稳定性。

2.2.3 米糠蛋白 米糠是一类产量大、价格低廉的谷物加工副产物，其蛋白营养价值高，过敏性低。常通过乳化法制备米糠蛋白纳米乳液作为植物多酚的纳米输送载体。纳米乳液是由两种不相溶的胶体分散体——水和油的混合物以及降低两相之间界面张力所需的合适乳化剂组成。与传统乳液相比，纳米乳液具有更小的液滴尺寸，可防止在贮藏过程中发生沉淀或乳化，延长食品的新鲜度和贮藏时间。

米糠蛋白作为一种天然大分子乳化剂，能为纳米乳液的形成提供表面活性。Chen等[36]利用米糠蛋白制备纳米乳液包埋槲皮素，该纳米乳液在碱性条件和低盐离子浓度下表现出良好的稳定性。封装后槲皮素的生物利用度从1.4%增加到12.7%。当槲皮素浓度为0.5 mol/L时，游离槲皮素和纳米乳液的细胞活力分别为86.84%和94.63%，表明纳米乳液的封装降低了槲皮素对细胞的毒性。同时纳米乳液增加了槲皮素的细胞渗透率，达4.93×10-6cm/s，比游离槲皮素高2×10-6cm/s。Liu等[37]将姜黄素以95.94%的包封率封装至基于米糠白蛋白的纳米乳液中，纳米乳液的DPPH自由基清除能力为90.87%，高于游离姜黄素的(70.12%)；与纳米乳液相比，游离姜黄素对ROS产生的抑制作用较弱，二者存在显著性差异；在MCF-7细胞系中，姜黄素纳米粒子对肿瘤细胞的抑制效果是游离姜黄素的1.66倍。综上，纳米乳液的抗氧化活性、抗炎活性和对肿瘤细胞的抗增殖活性均优于游离姜黄素。

2.2.4 其他植物蛋白 近年来，植物蛋白以其结构及功能特性优势成为食品和医药领域活性物质输送载体的研究热点，豌豆蛋白[38]、藜麦蛋白[39]、绿豆蛋白[40]和向日葵蛋白[41]等植物蛋白纳米输送载体的研究开发也逐渐被报道。植物蛋白对于植物多酚具有良好的包埋和保护作用，为植物多酚在功能性食品的应用提供了一种新的途径，但植物蛋白存在溶解度低、易致敏等局限性，需要对其结构进行改性或修饰，其载体性能还有待于进一步的研究和开发。

2.3 酶解物基植物多酚纳米载体

酶水解一方面改善了蛋白质的功能特性和界面特性，另一方面在酶解过程中产生的肽段往往还具有许多生理活性，对抗氧化、抗炎以及抗肿瘤均有一定的积极影响。蛋白酶解物具有天然的两亲性优势，可以利用非共价相互作用力，如氢键、静电相互作用和疏水相互作用等，自组装形成新的结构制备出纳米纤维、纳米管、纳米粒子等形式来输送植物多酚。韦翠兰等[42]发现经酶解后获得的小麦蛋白酶解物具备良好的界面活性，并以此为材料构建了荷载槲皮素的纳米输送体系，粒径约为75 nm，并将槲皮素溶解度提高了近 16 倍。Yuan等[43]将姜黄素包埋在大豆蛋白酶解物中，制备的纳米粒子粒径约80 nm，分布均匀，姜黄素的生物利用度从10%提高到85%。

与天然蛋白质相比，有限的酶水解可以提高蛋白质对疏水性化合物的递送能力，并开发出具有更小尺寸和稳定性更高的纳米载体[44]。Zhang等[45]将北方大豆蛋白酶解物作为纳米输送载体运输姜黄素，结果发现有限的水解(当水解度≤7%时)使载体的负载能力提高了约50%。Lan等[46]以菜籽粕衍生肽成功包埋β-胡罗卜素，并发现随着水解时间的延长，包封率逐渐提高到80%以上后趋于稳定；但是形成的纳米粒子的形状和尺寸不规则，可能是由于不同水解时间下的菜籽粕衍生肽的分子量和表面疏水性存在差异。

3 蛋白基纳米载体交联剂研究进展

蛋白质在等电点附近容易发生絮凝，且蛋白基纳米粒子易受盐离子和蛋白酶的影响，从而导致纳米输送体系包封率低和稳定性差。研究[47]表明，在蛋白质纳米载体的基础上引入交联剂对纳米粒子进行修饰，可得到包封效率更高、缓释效果更好的纳米输送材料。在药物输送体系开发中，为提高药物输送效率，常使用合成交联剂，常见的有戊二醛、硼酸、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺等[47]。合成交联剂潜在的毒性使其不适于食品领域，而食品领域多采用天然材料多糖、表面活性剂等与蛋白质进行复合提高纳米输送体系的稳定性。

3.1 多糖

多糖具有无毒无害、生物相容性好和来源广泛等优势。壳聚糖是常用的一种阳离子多糖，可为蛋白质纳米载体提供空间位阻作用及静电稳定效应。Pauluk等[48]制备出包埋白藜芦醇的玉米醇溶蛋白—壳聚糖纳米粒子，壳聚糖的存在提高了白藜芦醇在模拟胃肠液中的稳定性，与未添加壳聚糖的玉米醇溶蛋白纳米粒子相比，玉米醇溶蛋白—壳聚糖纳米粒子在模拟胃肠道中释放率降低了10%，被认为具有更好的缓释特性。果胶是常用的一类阴离子多糖，可与带正电的蛋白质基团产生强烈的静电吸引。Guo等[49]将姜黄素包埋在豌豆分离蛋白和果胶的复合物中，表现出比游离姜黄素更好的光和热稳定性：紫外线照射90 min后，姜黄素在高酯化果胶纳米粒子中保留率为53.32%，远高于游离姜黄素的(5%)；85 ℃水浴90 min后，高酯化果胶纳米粒子的姜黄素保留率约为50%，远高于游离姜黄素的(10%)。该研究还发现酯化程度高的果胶具有更好的包埋效果，比低酯化程度的果胶纳米粒子高约10%。

3.2 表面活性剂

在蛋白质基纳米载体的基础上加入表面活性剂可以改善其在高离子强度下的稳定性。Sun等[50]将酪蛋白酸钠加入玉米醇溶蛋白中以包埋二氢杨梅素，制得的纳米粒子在模拟肠液中的保留率比游离二氢杨梅素的高9%，二氢杨梅素包埋后生物利用度提高了1.95倍。Poureini等[51]以玉米醇溶蛋白与卵磷脂结合包埋芹菜素，制备出的纳米粒子的光稳定性(73%)高于单独玉米醇溶蛋白(38%)或卵磷脂(44%)与芹菜素制得的纳米粒子，玉米醇溶蛋白—卵磷脂—芹菜素纳米粒子在30 d的贮藏过程中表现出良好的稳定性。

3.3 交联剂联用

在制备纳米输送体系时，采用多种交联剂共同作用，可能出现相互协同作用，进一步提高纳米粒子的稳定性。Veneranda等[52]采用酪蛋白酸钠、果胶作为交联剂制备玉米醇溶蛋白—酪蛋白酸钠—果胶三元纳米复合物包埋丁香酚，得到的纳米粒子具有更小的尺寸(140 nm)，并呈现出优异的再分散性。Khan等[53]利用海藻酸盐中带负电荷的羧酸盐部分与壳聚糖中带正电荷的胺基相互作用形成聚电解质复合物，可以提高包埋物质的稳定性。制得的三元纳米粒子粒径约为160.9 nm，海藻酸盐—壳聚糖复合层改善了玉米醇溶蛋白纳米粒子中白藜芦醇的释放和生物利用度，三元纳米粒子在模拟胃液中释放的白藜芦醇从77%减少至31%，生物利用度从50%提高至81%。

4 结语

采用蛋白质作为植物多酚的纳米输送载体，可以有效提高植物多酚的稳定性、溶解度和生物利用度，有利于发挥植物多酚对人体健康的有益作用，并拓展其在食品领域中的应用范围。目前关于蛋白基纳米输送载体的研究已经涉及到多种蛋白，但单一的蛋白基植物多酚纳米输送载体还存在包封率低、稳定性差及胃肠控释性能低等问题。后续研究可考虑采用天然大分子复合材料共同构建植物多酚的纳米输送载体，以保证对植物多酚的有效输送；同时应重点开展蛋白基纳米颗粒和被包埋的植物多酚在生物体内消化吸收代谢情况的研究，进而解释其吸收和代谢机制，通过毒理学试验评估制备出的纳米输送体系对人体健康和环境的影响，为利用蛋白基纳米输送载体开发植物多酚功能性食品提供理论依据。