microRNAs 在呼吸道合胞病毒感染中的研究进展

杨红霞 姜敏

[摘要]呼吸道合胞病毒（RSV）是引起2岁以下儿童急性下呼吸道感染最常见的病原体，也是导致患儿住院的主要原因，对儿童健康构成了严重威胁，然而其具体的致病机制至今尚不清楚，目前也尚无有效的抗病毒药物及疫苗。microRNAs 是一种小的非编码 RNAs，是基因表达转录后调控中最重要的分子。研究显示多种 microRNAs 在 RSV 感染后出现异常表达，并可通过参与先天免疫反应、调控淋巴细胞分化、影响细胞因子生成等机制在 RSV 感染后发挥调节作用，很可能是 RSV 感染诊断的潜在生物标记和治疗靶点。本文综述 microRNAs 在 RSV 感染中的研究进展，为探讨 RSV 的致病机制及抗病毒药物和疫苗的研发提供新的思路。

[关键词]呼吸道合胞病毒; microRNAs;儿童;急性下呼吸道感染

[中图分类号] R392  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2022）08-0055-05

Research progress of microRNAs in respiratory syncytial virus infection

YANG  Hongxia    JIANG  Min

Department of Pediatrics， Shenzhen University General Hospital， Guangdong， Shenzhen 518000， China

[Abstract] Respiratory syncytial virus （RSV） is the most common pathogen causing acute lower respiratory tract infection in children under 2 years old. It is also the main cause of hospitalization and poses a serious threat to children’s health. However， its specific pathogenesis is still unclear， and there is no effective antiviral drug and vaccine at present. MicroRNA， a small non-coding RNA， is the most important molecule in post- transcriptional regulation of gene expression. Studies have shown that a variety of microRNAs are abnormally expressed after RSV infection， and can play a regulatory role after RSV infection by participating in innate immune response， regulating lymphocyte differentiation and affecting cytokine production and other mechanisms of action. MicroRNA is likely to be a potential biomarker for the diagnosis of RSV infection and the therapeutic target. This paper reviews the research progress of microRNAs in RSV infection， so as to provide new ideas for exploring the pathogenic mechanism of RSV and for the research and development of antiviral drugs and vaccines.

[Key words] Respiratory syncytial virus; MicroRNAs; Children; Acute lower respiratory tract infection

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）是引起2歲以下儿童急性下呼吸道感染最常见的病原体，也是导致患儿住院的主要原因[1]。据统计，每年约有300万 RSV 感染的患儿需住院治疗，其中约有66000～199000患儿因感染 RSV 而死亡，对儿童健康构成了严重威胁[2]。然而其具体的致病机制至今尚不清楚，目前也尚无有效的抗病毒药物及疫苗。microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码 RNAs，是基因表达转录后调控中最重要的分子。近年来的研究显示，多种 miRNAs 在 RSV 感染后出现异常表达[3]。本文对 miRNAs 在 RSV 感染中的研究进展做一综述，为探讨 RSV 的致病机制及抗病毒药物和疫苗的研发提供新的思路。

1 miRNAs简介

miRNAs 是1993年在秀丽隐杆线虫中发现的一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码调节 RNA。目前已知人类基因组可编码1000余种 miRNAs，调控大约60%的蛋白质编码基因的表达[4]。

miRNAs 的合成主要包括以下几个过程：首先在细胞核内由 RNA 聚合酶Ⅱ作用，从内源的 miRNA 基因组 DNA 转录成双链的pri-miRNA，然后pri-miRNA 被核糖核酸酶Ⅲ Drosha 切割为长度60～100 nt的 pre-miRNA 并被 exportin-5-RNA- GTP 复合体运送至胞质，在胞质内 pre-miRNA 被另一种核糖核酸酶 Dicer 切割为一种短的双链 RNA，该双链 RNA 的一条链进入 RNA 诱导沉默复合体 RISC 中，成为具有生物功能的成熟 miRNAs。

与RISC结合的miRNA5’端包含一段保守的长约6～8个碱基的“种子序列”，该序列可以部分或完全碱基互补配对的方式与靶mRNA 的3’非编码区（ 3’UTR）相结合，从而诱导靶基因mRNA降解/裂解或翻译抑制。miRNAs可参与细胞的增殖、分化、凋亡、形态的形成以及肿瘤的发生等多个生物过程。随着研究的不断深入，miRNAs越来越多的新功能被发现，如后天修饰、促进新生mRNA的有效剪接、调节其他ncRNAs 的表达及功能等I5l。目前已经在癌症心脏病变、气管病变、病毒感染等多种疾病中检测到了miRNAs表达的改变/6-8]。2RSV感染引起的miRNAs表达谱改变

RSV是肺炎病毒科正肺病毒属的一种有包膜的单股负链RNA病毒，其核酸包含10个基因，共编码NS1、NS2、N、P 、M 、S H、G 、F 、M2-1、M2-2和L11种蛋白质。RSV的基因组RNA被包裹在由N蛋白、L蛋白、P蛋白及M2-1蛋白组成的核衣壳中，而黏附蛋白G、融合蛋白F及小疏水蛋白SH 则嵌入在病毒的被膜中。RSV感染后病毒蛋白和宿主细胞释放的递质均可诱导miRNAs的异常表达。

miRNAs 的生物合成与其他细胞信号通路之间存在复杂的交叉，而 RSV的G蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白可通过影响细胞信号转导来影响miRNAs 的生物合成。RSV的G蛋白可诱导宿主细胞中 let-7f表达上调，通过靶向作用于CCL7和细胞因子信号通路3抑制因子减弱宿主的抗病毒反应0。mNS1和 NS2蛋白则可分别通过IFN-β和核因子一x B（ nuclear factor- K B，NF- x B）信号通路抑制let-7i和miR-30b的表达，NS1蛋白还可通过转化生长因子-β （ transforming growth factor- β ， TGF-β ）来调节miR-24的表达。

2.1 RSV感染的体外细胞实验中miRNAs表达谱的改变

RSV感染对miRNAs表达的影响已在多种胞类型的体外细胞实验中得到证实，包括细胞系（如A549、Hep—2、极化Calu—3等）和原代培养细胞[如正常人支气管上皮细胞（NHBEs）、小肺泡上皮细胞（SAECs）、单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）等]。在感染了RSV的A549细胞中检测到let-7f、miR-24、miR-337-3p、miR-26b和miR- 520a—5p表达上调，而miR—198和miR—595表达下调0。在RSV持续感染的Hep—2细胞中检测到miR-146-5p表达上调，而miR-let-7c-5p、miR-221和 miR-345-5p表达下调"。在RSV感染的moDCs中检测到let—7b的表达较未感染细胞增高。RSV也可显著改变NHBEs中miRNAs的表达谱，既往研究显示有24个miRNAs表达下调，2个miRNAs表达上调2。

RSV感染还可导致外泌体中miRNAs的表达改变，如let-7a、let-7f、miR-320a、miR-21、miR-22 和miR-4449等13。CHAHAR等4的研究显示来自RSV感染的A549细胞的外泌体中有56种miRNAs表达上调，10种miRNAs表达下调。

2.2 RSV感染的患儿临床标本中miRNAs表达谱的改变

在RSV感染的婴儿外周血和鼻黏膜样本等临床标本中，也检测到了miRNAs表达谱的改变。其中在婴儿外周血标本中表达上调的miRNAs包括 miR-106b-5p、miR-181a-5p、miR-20b-5p、 miR-342-3p和miR-652-3p，表达下调的miRNAs 包括miR-122-5p、miR-320d、miR-320e、miR-877-5p、 miR-92b-5p和let-7c-5p5l。而在鼻黏膜样本中表达上调的miRNAs包括miR-155、miR-31、miR-203a、 miR-16和let-7d，表达下调的miRNAs包括miR-34b、 miR-34c、miR-125b、miR-29c、miR-125a、miR-429 及miR-27b16。INCHIEY等6的研究结果显示miR—125a和miR—429在RSV感染程度不同的患儿鼻黏膜样本中的表达水平不同：在轻症患者中表达下调，而在重症患者中则未表达下调。

3 miRNAs在RSV感染中的作用

RSV主要通过G蛋白与宿主细胞黏附，通过F

蛋白与宿主细胞膜融合，然后将RNA注入宿主细胞内，利用宿主细胞器及原料进行病毒核酸的复制及蛋白质的合成。RSV能否成功感染宿主细胞主要取决于是否可利用宿主细胞器及原料执行其生物功能。miRNAs可有效调节基因转录后表达的水平，可参与多种关键细胞信号的表达，是RSV病毒繁殖的理想工具。RSV感染后可显著改变宿主细胞内miRNAs的表达，正向或负向调节病毒的复制、免疫应答等过程，从而影响感染的结局。

3.1 miRNAs参与先天免疫应答

先天免疫应答是人体抵御病毒入侵的第一道防线，而miRNAs可参与RSV感染后先天免疫应答中上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、单核细胞及自然杀伤细胞等多种细胞功能的调节。

RSV的主要靶细胞是气道上皮细胞，当RSV感染气道上皮细胞后，可被细胞表面的模式识别受体视黄酸诱导基因I样受体（retinoic acid-inducible gene I-like receptors，RLRs）及Toll样受体（Toll like receptors， TLRs）识别，促进促炎细胞因子、趋化因子、干扰素等的产生[17]。在气道上皮细胞中， Toll 样受体信号通路可参与模式识别受体识别 RSV 的过程，而 miR-146a 可通过靶向 IL-1受体相关激酶1（IL-1 receptor associated kinase 1， IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor  associated factor 6， TRAF6）負性调控 TLRs 信号通路。在中性粒细胞及单核细胞中刺激 TLR2、TLR4和 TLR7/8，可触发有 MyD88接头分子参与的信号通路的激活，并导致 miR-9在中性粒细胞和单核细胞中表达增加[18]。在巨噬细胞中， miR-27a 可负性调控 IL-10依赖的信号传感器及信号传导及转录激活因子3（signal transducer and activator of  transcription 3， STAT3）磷酸化，从而减轻TLR2及 TLR4驱动的炎症反应[19]。miRNAs 也可通过靶向连接蛋白及转录因子调节 M1和 M2巨噬细胞极化，进而参与炎症反应的调控[20]。另外，miRNAs 还可调节树突状细胞的分化与成熟、抗原的呈递等，连接先天免疫与适应性免疫[21]。

miRNAs 在先天免疫应答中也可调控细胞因子的表达。RSV 的 G 蛋白可通过下调 let-7i 调节病毒的复制和宿主基因表达的模式，从而促进干扰素-λ（interferon-λ， IFN-λ）的分泌以诱导上皮细胞的抗病毒反应[9]。RSV 感染后下调的 miR-221可通过增加神经生长因子（nerve growth factor， NGF）及其受体原肌球蛋白相关激酶 A （tropomyosin-associated kinase A，TrkA）的表达，干扰宿主细胞的凋亡，促进病毒复制[12]。miR-21、 miR-125可通过抑制白三烯 B4（leukotriene B4，LTB4）合成的关键酶5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX），抑制 LTB4的合成，而 LTB4在 RSV 感染后气道高反应性中发挥重要作用[2]。

3.2  miRNAs参与淋巴细胞的增殖、分化和凋亡

RSV 感染后刺激机体产生适应性免疫应答，适应性免疫是人体对抗病毒的抗原特异性防御系统的一部分，主要由 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞介导， miRNAs 可参与 RSV 感染后淋巴细胞的增殖、分化、成熟和凋亡[22]。既往研究表明 miR-21、miR-155和 miR-17-92簇可调控 T 淋巴细胞的增殖、活化及存活时间。miR-23～27～24簇可参与效应 T 细胞的分化和成熟[23]。miR-142-3p 可调控 CD4+ CD25+T 细胞的增殖，进而抑制 Treg 细胞的增殖并降低免疫耐受。miRNAs 在同一细胞的不同分化阶段表达也不同，如 miR-150仅在成熟的静息 T、B 淋巴细胞中被发现，而在它们的前体细胞中则表达较少，甚至不表达;miR-146a 在记忆 T 淋巴细胞中高表达，而在幼稚 T 细胞中则表达较少[18]，故认为 miRNAs 很可能是 RSV 感染诊断的潜在生物标记。 miR-146a 还可靶向作用于Fas相关死亡结构域，影响细胞凋亡的激活[18]。最近的研究表明 miRNAs 还可以外泌体的形式参与抗原提呈、细胞的迁移和分化[24]，其中 miR-21、miR-150、miR-320及 let-7家族在外泌体中较常见。

3.3  miRNAs调控免疫细胞的功能及其细胞因子的产生

miRNAs 也可影响 RSV 感染后免疫细胞的功能，并调控其细胞因子的产生。miR-17-92簇中的成员 miR-19可促进 Th2细胞分化及 Th2型细胞因子 IL-13的产生。Ramelli等[25]的研究显示，在哮喘患者中 miR-19a 可直接靶向作用于 PTEN、 SOCS1和 TNFAIP3，这3种 mRNAs 分别各编码一种 PI（3）K、JAK-STAT 和 NF-κB通路的抑制剂， miR-19a 可同时放大 PI（3）K、JAK-STAT 和 NF-κB通路信号，促进 Th2细胞因子 IL-13的产生，而 IL-13是气道炎症的关键因素，可诱导上皮细胞增殖、黏液生成、气道高反应性和嗜酸性粒细胞募集。在哮喘小鼠模型中， miR-19b 可通过下调胸腺基质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）抑制 STAT3信号通路，从而减轻气道重塑、气道炎症及氧化应激的程度[26]。

miR-21可通过作用于靶基因 IL-12p53的3’UTR，抑制 Th1细胞因子的产生，增强 Th2细胞免疫途径[27]。LEE 等[28]的研究表明，与野生型哮喘小鼠相比， miR-21基因敲除的哮喘小鼠嗜酸性气道炎症及气道高反应性均明显降低，且支气管肺泡灌洗液中 Th2型细胞因子 IL-4、IL-5及 IL-13均表达减少，而 IL-12和 IFN-γ则表达增加。KIM 等[29]的研究也显示，在 RSV 感染诱导的激素不敏感小鼠气道过敏性疾病模型中，给予 miR-21拮抗剂可抑制嗜酸性粒细胞炎症及气道高反应性。

而 let-7主要影响 Th2型细胞因子 IL-13的表达，其作用靶点是 IL-13 mRNA 的3’UTR， Kumar 等[30]的研究发现 let-7可通过减少 IL-13的分泌减轻气道炎症、上皮下纤维化及气道高反应性。

此外， miR-31可增加 T 细胞对Ⅰ型干擾素的敏感性，从而干扰效应 T 细胞的功能及与 T 细胞功能障碍相关的蛋白质的表达。miR-155可参与 CD8+T 细胞介导的抗病毒反应，miR-155缺陷的 CD8+T 细胞的效应反应减弱，并优先分化为记忆细胞。miR-24和 miR-27可通过直接或间接靶向 IL-4及 GATA3抑制 Th2细胞免疫反应。

4小结及展望

RSV 是导致2岁以下儿童住院甚至病死的重要病原体，严重威胁儿童健康。miRNAs 可通过参与先天免疫反应、调控淋巴细胞分化、影响细胞因子生成等机制在 RSV 感染后发挥调节作用，很可能是判断疾病严重程度的潜在生物标记和治疗靶点。虽然越来越多的 miRNAs 被发现在 RSV 感染后表达异常，但绝大部分 miRNAs 的作用靶点及调控机制仍不清楚。且大部分研究数据主要来源于体外培养的细胞系及动物模型，其结果不可能完全准确地反映 RSV 感染人体后免疫应答的过程。因此，探索 RSV 感染人体后 miRNAs 的表达谱变化及不同种类 miRNAs 的作用靶点、理清 miRNAs 在 RSV 感染中的作用机制将是今后研究的重点和方向。

[参考文献]

[1] GRIFFITHS C， DREWS SJ， MARCHANT DJ.RespiratorySyncytial Virus： Infection， Detection， and New Options for Prevention and Treatment[J].Clin Microbiol Rev，2017，30（1）：277-319.

[2] SHI T，MCALLISTER D A，O'BRIEN K L，et al.Global，regional， and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015： a systematic review andmodelling study[J].Lancet，2017，390（10098）：946-958.

[3] Liu Z， Fan P， Chen M， et al.miRNAs and Leukotrienesin Respiratory Syncytial Virus Infection[J].Front Pediatric，2021，9：602195.

[4] BARTEL DP.METAZOAN.MicroRNAs[J].Cell，2018，173（1）：20-51.

[5] CATALANOTTO C，COGONI C，ZARDO G.MicroRNAin Control of Gene Expression： An Overview of Nuclear Functions[J].Int J Mol Sci，2016，17（10）：1712.

[6] ALI SYEDA Z，LANGDEN SSS，MUNKHZUL C，et al.Regulatory Mechanism of MicroRNA Expression in Cancer[J].Int J Mol Sci，2020，21（5）：1723.

[7] CAKMAK H A，DEMIR M.MicroRNA and CardiovascularDiseases[J].Balkan Med J，2020，37（2）：60-71.

[8] NAROZNA B， LANGWINSKI W， SZCZEPANKIEWICZA.Non-Coding RNAs in Pediatric Airway Diseases[J]. Genes （Basel），2017，8（12）：348.

[9] BARKERA A，HARCOURT JL，HAYNES LM，et al.The Central Conserved Region （CCR） of Respiratory Syncytial Virus （RSV） G Protein Modulates HostmiRNA Expression and Alters the Cellular Response toInfection[J].Vaccines （Basel），2017，5（3）：16.

[10] BAKRE A，MITCHELL P，COLEMAN JK，et al.Respiratory syncytial virus modifies microRNAs regulating host genes that affect virus replication[J].J Gen Virol，2012，93（11）：2346-2356.

[11] EILAM_FRENKEL B，NAAMAN H，BRKIC G，et al.MicroRNA 146-5p， miR-let-7c-5p， miR-221 and miR-345-5p are differentially expressed in Respiratory Syncytial Virus （RSV） persistently infected HEp-2 cells[J].Virus Res，2018，251：34-39.

[12] OTHUMPANGAT S， WALTON C， PIEDIMONTEG.MicroRNA-221 modulates RSV replication in human bronchial epithelium by targeting NGF expression[J]. PLoS One，2012，7（1）：e30030.

[13] WU W，CHOI EJ，LEE I，et al.Non-Coding RNAsand Their Role in Respiratory Syncytial Virus （RSV） and Human Metapneumovirus （hMPV） Infections[J]. Viruses，2020，12（3）：345.

[14] CHAHAR HS，CORSELLO T，KUDLICKI AS，et al.Respiratory Syncytial Virus Infection Changes Cargo Composition of Exosome Released from Airway Epithelial Cells[J].Sci Rep，2018，8（1）：387.

[15] WANG S，LIU P，YANG P，et al.Peripheral bloodmicroRNAs expression is associated with infant respiratory syncytial virus infection[J].Oncotarget，2017，8（57）：96627-96635.

[16] INCHIEY CS，SONERUD T，FJAERLI O，et al.Nasal mucosal microRNA expression in children with respiratory syncytial virus infection[J].BMC Infect Dis，2015，15（1）：150.

[17] FENG S，ZHANG L，BIAN XH，et al.Role of theTSLP-DC-OX40L pathway in asthma pathogenesis and airway inflammation in mice[J].Biochem Cell Biol，2018，96（3）：306-316.

[18] GLOBINSKA A，PAWELCZYK M，KOWALSKIML.MicroRNAs and the immune response to respiratory virus infections[J].Expert Rev Clin Immunol，2014，10（7）：963-971.

[19] XIE N，CUI H，BANERJEE S，et al.miR-27a regulatesinflammatory response of macrophages by targeting IL-10[J].J Immunol，2014，193（1）：327-334.

[20] SELF-FORDHAM JB，NAQVI R，UTTAMANI JR，etal.MicroRNA： Dynamic Regulators of Macrophage Polarization and Plasticity[J].Front Immunol，2017，8：1062.

[21] MARTINEZ-ESPINOZA I， BANOS-IARA MDR，GUERRERO-PLATA A.The Importance of miRNA Identification During Respiratory Viral Infections[J].J Cell Immunol，2021，3（4）：207-214.

[22] KROESEN B J，TETELOSHVILI N，SMIGIELSKA-CZEPIEL K，et al.Immuno-miRs： critical regulators of T-cell development， function and ageing[J]. Immunology，2015，144（1）：1-10.

[23] CHO S，WU CJ，YASUDA TE.miR-23～27～24clusters control effector T cell differentiation and function[J].JExpMed，2016，213：235-249.

[24] OKOYE IS，COOMES SM，PELLY VS，et al.MicroRNA-Containing T-Regulatory-Cell-Derived Exosomes Suppress Pathogenic T Helper 1 Cells [J].Immunity，2014，41（3）：503.

[25] Ramelli SC，GerthofferWT.MicroRNA Targets forAsthma Therapy[J].Adv Exp Med Biol，2021，1303：89-105.

[26] YE L， MOU Y， WANG J， et al.Effects of microRNA-19b on airway remodeling， airway inflammation and degree of oxidative stress by targeting TSLP through the Stat3 signaling pathway in a mouse model of asthma[J].Oncotarget，2017，8（29）：47533-47546.

[27] VARIKUTI S，VERMA C，HOLCOMB E，et al.MicroRNA-21 Deficiency Promotes the Early Th1 Immune Response and Resistance toward VisceralLeishmaniasis[J].J Immunol，2021，207（5）：1322-1332.

[28] LEE HY，HUR J，KANG JY，et al.MicroRNA-21Inhibition Suppresses Alveolar M2 Macrophages in an Ovalbumin-Induced Allergic Asthma Mice Model[J].Allergy Asthma Immunol Res，2021，13（2）：312-329.

[29] KIM RY，HORVAT JC，PINKERTON JW，et al.MicroRNA-21 drives severe， steroid-insensitive experimental asthma by amplifying phosphoinositide 3- kinas e- m ediated s uppres s ion of his tone deacetylase 2[J].J Allergy Clin Immunol，2017，139（2）：519-532.

[30] KUMAR M，AHMAD T，SHARMA A，et al.Let-7microRNA-mediated regulation of IL-13 and allergic airway inflammation[J].J Allergy Clin Immunol，2011，128（5）：1077-1085.

（收稿日期：2021-11-30）