产前无创基因检测在胎儿性染色体非整倍体疾病筛查中的临床价值

徐云芝，徐雪琴，唐少华，周丽丽，李焕铮

温州市中心医院 产前诊断中心，浙江 温州 325000

性染色体非整倍体疾病（sex chromosome aneuploidies, SCAs）主要包括Turner综合征（45,X）、超雌综合征（47, XXX）、克氏综合征（47, XXY）、超雄综合征（47, XYY）。人群发病率为1/500，活产率为1/350～1/400[1-2]。临床表现为女性闭经、不孕、反复流产，男性无精子症、不育，可伴有其他脏器结构和功能异常，以及一定程度的智力低下和精神障碍等。性染色体异常很少致死，其中大部分（45,X）胎儿在孕期会自然流产，而其他SCAs胎儿很难通过B超检查发现，以致产前SCAs容易漏诊[3]。

1997年LO等[4]首次在孕妇外周血中发现胎儿游离DNA，并由此开辟了全新的无创产前基因检测（non-invasive prenatal testing, NIPT）技术领域。2011年NIPT首次用于21-三体的商业化检测，后又用于13-三体、18-三体等。除检测常染色体疾病外，NIPT对性染色体非整倍体的检测也有较高的准确性[5-6]。

本研究通过分析温州市中心医院行NIPT或扩展性NIPT（NIPT PLUS）筛查胎儿SCAs的检出效能，评价其在胎儿SCAs中的临床应用价值，为提高NIPT在临床的应用提供参考与借鉴。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年1月至2019年12月于温州市中心医院行NIPT普通三项或NIPT PLUS的单活胎孕妇27 116 例为研究对象，其中NIPT普通三项有15 218例，NIPT PLUS有11 948例。纳入标准：①经B超检查确定孕周12～22+6周；②单胎妊娠；③知情同意下自愿行NIPT或NIPT PLUS检测。排除标准：①孕妇患染色体异常疾病；②孕妇接受过移植手术、免疫治疗等。检测结果阳性的孕妇被召回，建议遗传咨询，经本人及家属同意行羊膜腔穿刺及羊水染色体核型分析。本研究经温州市中心医院伦理委员会审批，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 NIPT检查：抽取孕妇10 mL外周血到EDTA抗凝管中，离心，取上层血浆，采用北京贝瑞公司生产的DNA提取试剂盒提取胎儿游离DNA，构建文库，通过Illumina高通量基因测序平台进行样本测序检测。下机后通过计算X或Y染色体reads所占比例和Z值来评估性染色体非整倍体异常情况[Z=（纠正后的样本%chrN-参考样本的%chrN平均值）/参考样本的%chrN的标准差]。判断规则[7]如下：chrX的Z值参考范围设为-2.91～2.91，chrY的Z值阈值设为3。对于正常男性胎儿，其chrX的Z值和chrY的Z值呈负线性相关，因此当chrX的Z值为-2.91～2.91，chrY的Z值小于3，则胎儿性别核型为XX；当chrX的Z值小于-2.91，chrY的Z值小于3，则胎儿性别核型为X；当chrX的Z值大于2.91，chrY的Z值小于3，则胎儿性别核型为XXX；当chrX的Z值为-2.91～2.91，chrY的Z值大于3，则胎儿性别核型为XYY；当chrX的Z值小于-2.91，chrY的Z值大于3，且符合线性关系，则胎儿性别核型为XY，否则为XYY。

1.2.2 NIPT PLUS检查：同上述方法提取胎儿游离DNA，构建文库，上机，产出的原始测序数据量约为NIPT的5倍。下机后运用RUPA算法进行序列比对并剔除含异常GC比例和低覆盖率的测序数据，同时通过PCA分析方法提高信噪比以获取准确的测序数据。评判规则同上。

1.2.3 随访方法：对检测结果提示高风险者，召回并进行遗传咨询，告知侵入性产前诊断风险，签署知情同意书。在超声指引定位下无菌操作环境中行经腹羊膜腔穿刺术，抽取20 mL羊水，进行羊水细胞培养、收获、制片、G显带。根据人类国际细胞遗传学命名体系（ISCN2016）进行核型计数和分析。

2 结果

2.1 NIPT普通三项对SCAs的检测结果 15 218例孕妇中NIPT普通三项提示SCAs高风险125例，筛查阳性率为0.82%（125/15 218）。性染色体数目减少（45, X）55例，性染色体数目增多70例，其中超雌综合征（47, XXX）36例，克氏综合征（47, XXY）27例，超雄综合征（47, XYY）7例。

2.2 NIPT普通三项检测结果与染色体核型分析结果比较 NIPT普通三项提示125例SCAs高风险，其中仅70例选择在我院行羊水穿刺。经染色体核型分析，有17例被确诊为胎儿患有不同类型的SCAs，阳性预测值为24.29%（17/70），见图1。NIPT普通三项提示性染色体数目减少（45, X）的55例中，34例选择羊水穿刺，染色体核型结果符合4例，阳性预测值11.76%（4/34）。NIPT普通三项提示性染色体数目增多的70例中，36例选择羊水穿刺，染色体核型结果符合13例，阳性预测值36.11%（13/36），其中（47,XXX）、 （47, XXY）和（47, XYY）的阳性预测值分别为22.22%（4/18）、46.67%（7/15）、66.67%（2/3）。见表1。

图1 NIPT普通三项提示SCAs高风险者的羊水核型图

表1 NIPT普通三项对胎儿SCAs筛查的效能分析

2.3 NIPT PLUS对SCAs的检测结果 11 948例孕妇中NIPT PLUS提示SCAs高风险97例，筛查阳性率为0.81%（97/11 948）。性染色体数目减少（45, X）41例，性染色体数目增多56例，其中超雌综合征（47, XXX）22例，克氏综合征（47, XXY）28例，超雄综合征（47,XYY）6例。

2.4 NIPT PLUS检测结果与染色体核型分析结果比较 NIPT PLUS提示97例SCAs高风险，其中70例选择在我院行羊水穿刺。经染色体核型分析，有29例被确诊为胎儿患有不同类型的SCAs，阳性预测值为41.43%（29/70），见图2。NIPT PLUS提示性染色体数目减少（45, X）的41例中，29例选择羊水穿刺，染色体核型结果符合5例，阳性预测值17.24%（5/29）。NIPT PLUS提示性染色体数目增多的56例中，41例选择羊水穿刺，染色体核型结果异常24例，阳性预测值58.54%（24/41），其中（47, XXX）、 （47,XXY）和（47, XYY）的阳性预测值分别为52.94%（9/17）、 60.00%（12/20）、75.00%（3/4）。见表2。

表2 NIPT PLUS对胎儿SCAs筛查的效能分析

图2 NIPT PLUS提示SCAs高风险者的羊水核型图

3 讨论

跟常规的产前筛查相比，NIPT具有更高的敏感度和特异度，对于常见的21-三体、18-三体、13-三体的阳性预测值较高，尤其是21-三体的阳性预测值高达95%。染色体核型分析因其高准确性等优点成为染色体非整倍体产前诊断的金标准，但胎儿细胞的获得手段均为有创穿刺，存在宫内感染、早产、流产等风险，难以普及。自NIPT应用于临床以来，大大减少了侵入性产前诊断的数量。一项回顾性研究显示，该医院自2012年应用NIPT之后，羊膜穿刺术减少了76%，绒毛穿刺术减少了54%[8]。

回顾近年关于NIPT筛查SCAs的研究，发现其检测准确性具有较大差异，阳性率为0.31%～0.65%，阳性预测值为30%～80%[9-11，13-17]。MARGIOTTI等[11]对9 985 例孕妇进行NIPT检测分析得出SCAs总体阳性预测值为77.27%（17/22）， （45, X）阳性预测值为69.23%， （47, XXX）阳性预测值为100%， （47,XXY）阳性预测值为80%， （47, XYY）阳性预测值为100%。SONG等[12]研究中SCAs筛查的阳性预测值为54.55%（24/44）， （45, X）的阳性预测值为23.53%（4/17）， （47, XXX）、 （47, XXY）和（47, XYY）的阳性预测值分别为70%、75%和80%。SUO等[13]研究中SCAs阳性预测值为46.88%，（45, X）的阳性预测值为32.43%， （47, XXX）、 （47, XXY）、 （47, XYY）的阳性预测值分别为55.56%、60%、87.5%。

在本研究15 218例行NIPT普通三项的单胎孕妇中，SCAs高风险者125例，阳性率为0.82%，总体阳性预测值为24.29%。2017年中旬开始我院试运行NIPT PLUS。与传统NIPT相比，NIPT PLUS在实验技术和数据分析上均做了相应改进，以期提高NIPT的检出效能。对11 948例单胎妊娠孕妇行NIPT PLUS检测分析得出SCAs阳性率为0.81%，总体阳性预测值为41.43%。两者SCAs阳性率基本一致，对性染色体数目增多的阳性预测值（NIPT普通三项：36.11%；NIPT PLUS：58.54%）高于性染色体数目减少者（NIPT普通三项：11.76%；NIPT PLUS：17.24%），与文献[18-19]报道类似。NIPT或NIPT PLUS对包含Y染色体的SCAs的检测效能更高，但对（45, X）的检测准确性还有待提高。与NIPT普通三项相比，NIPT PLUS大大提高了SCAs总体阳性预测值，且各类SCAs的阳性预测值均有提高，但仍存在较高的假阳性。对NIPT或NIPT PLUS结果提示低风险者进行电话随访，暂未发现SCAs患儿。目前鲜少有文献谈及NIPT的SCAs阴性预测值。在采用高通量测序对570例孕妇进行SCAs筛查的研究中，阴性预测值为100%[20]。LIANG等[7]对412例孕妇进行NIPT检测的研究也提示SCAs阴性预测值为100%。鉴于此疾病临床异质性强，社会及群众认知不足，但仍无法排除假阴性的可能。关于造成NIPT结果与核型结果不符的原因可能与以下因素相关[3，21]：①X染色体的胸腺嘧啶和胞嘧啶的偏移及鸟嘌呤和胞嘧啶的测序偏差；②Y染色体跟其他染色体有较多相似片段，降低了测序信噪比；③胎儿游离DNA比例过高或过低；④胎儿嵌合体；⑤胎儿性染色体结构异常；⑥母体染色体核型异常，包括未知的母体嵌合体和拷贝数异常；⑦母源性肿瘤；⑧局限性胎盘嵌合（confined placental mosaicism,CPM）等。近30%的NIPT假阴性或假阳性是由CPM造成的，约1%的妊娠会发生CPM，且X染色体单体的CPM多发，那么针对SCAs筛查，NIPT的假阴性或假阳性是无法避免的。

关于该项技术在SCAs上的应用问题，美国医学遗传与基因组学会曾在2016年发表声明指出，应告知孕妇NIPT可用于SCAs筛查，但其假阳性较高[22]。

综上，NIPT可做为SCAs产前筛查方法，具有较高的临床应用价值，但其检测效能仍有待提高。在检测前应充分告知该项技术的优势和局限性，对于高风险病例需进一步产前诊断，对于低风险病例要警惕漏诊可能。由于SCAs患者可能无明显表型，确诊者均应进行详细的遗传咨询，慎重考虑胎儿的去留。