利用口腔前庭沟进行口腔微生态干预的可行性探究：以益生菌棉条为例

潘彬惠，施江敏，季夏薇，陈华森，徐昌隆

1.温州医科大学 第二临床医学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第二医院 消化内科，浙江 温州 325027

人类口腔中存在许多微生物，成年人口腔中有500～1 000亿细菌，其中占主要部分的有200多种[1]。多种口腔微生物的协同和相互作用，可以帮助人体抵御外界不良刺激的入侵[2]。当口腔微生态平衡被打破时，致病菌特别是兼性厌氧菌大量繁殖，通过直接入侵或引起免疫-炎症反应扩散至全身循环中，导致疾病的发生。研究表明，失衡的口腔菌群不仅与龋齿[3-4]、牙周炎[5]、口腔癌症[6]等多种口腔疾病相关，还在全身系统性疾病的发生发展中起着重要的作用[7-10]。作为全身微生态系统的一份子，与身体其他部位相比，口腔中的菌群独特且易于获得。因此，以口腔微生态为切入点研究口腔及全身系统性疾病，是一种无创、简单且有效的手段。

口腔前庭沟为位于唇、颊与牙列、牙龈及牙槽骨、牙弓之间的蹄铁形的潜在腔隙，见图1。此处温暖潮湿，密闭性好，是口腔微生物特别是厌氧致病菌易于聚集性生长之处。利用此间隙容纳异物的能力，可构建一种吸水性强、异物感弱的载体模型，该载体不仅可以对口腔原生态菌液进行提取，研究口腔微生态及相关代谢产物的构成，并且可以通过该载体人工干预口腔原生态环境。目前临床上通过干预口腔原生态环境影响口腔健康及系统相关性疾病的研究尚不完善，通过口腔前庭沟干预口腔菌群的工作鲜见报道。本研究以口腔前庭沟的利用为切入点，探讨干预口腔微生态的方法，以期为口腔保健及全身系统相关疾病研究提供一种新的思路。

图1 口腔前庭沟示意图

1 对象和方法

1.1 材料 无菌棉条购自南昌恩惠医用卫生材料有限公司，无菌冻存管购自美国Corning公司，唾液采集器购自杭州新景生物试剂开发有限公司，冻干菌粉购自上海奕农生物科技有限公司。

1.2 受试者和分组 选取温州医科大学附属第二医院消化内科的研究生10名，根据是否龋齿将受试者分为2组（每组n=5）：龋齿组、正常对照组。

纳入标准：①成年志愿者，身体健康状况良好；②日常口腔卫生习惯良好，每日早晚各刷牙一次；③研究期间能接受并严格遵守试验规则，不使用除本干预措施之外的任何口腔护理产品（包括含抗生素的漱口液、抑菌牙膏、木糖醇口香糖等），保证受试期间饮食平衡与平常一致。排除标准：①体质量指数（bady mass index, BMI）＞30 kg/m2；②任何可能干扰研究结果的家族遗传性疾病或者严重系统性疾病；③近1个月内服用抗生素，6个月内服用激素或者免疫抑制剂，6个月内接受过防龋治疗；④日常食用益生菌习惯者，日常咀嚼木糖醇口香糖习惯者；⑤口腔黏膜发生有临床意义的病变：如鹅口疮、感染性口炎、地图舌、口角炎、慢性唇炎等。本研究获得温州医科大学附属第二医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.3 棉条菌液采集有效性观察 随机选取正常对照组中的2名受试者（受试者A和B），分别通过无菌棉条（受试者A：Cott 1；受试者B：Cott 2）及唾液采集器（受试者A：Sali 1；受试者B：Sali 2）采集口腔唾液，对比分析其唾液中的菌群组成及短链脂肪酸含量。具体操作过程：①无菌棉条留取棉条唾液：a.由同一工作人员于受试者入睡前将无菌棉条用无菌镊子置于口腔内过夜，位置为双侧下颌第一磨牙与正对颊黏膜之间的空隙；b.嘱受试者入睡至次晨勿饮水、漱口、饮食、刷牙；c.次晨5点由同一工作人员用无菌镊将无菌棉条取出，置于2 mL冻存管中，记录湿重，并记录取出棉条的位置，保存于-80 ℃冰箱中。②唾液采集器采集液体唾液：a.在采集唾液样本前30 min，嘱受试者用饮用水将口腔内的杂物洗漱干净；b.用舌尖抵住上颚或下颚齿根以富集唾液，向采集漏斗中轻轻吐入唾液至刻度线高度；c.使唾液与唾液保存液充分混匀后保存于-80 ℃冰箱中。③检测样本中菌群组成及短链脂肪酸含量：利用16S rDNA扩增测序及靶向代谢组学技术检测并比较棉条唾液及唾液采集器采集的唾液中的菌群组成及短链脂肪酸含量。

1.4 益生菌棉条干预口腔微生态 将浸润冻干菌粉的益生菌棉条，分别置于龋齿组及正常对照组的口腔中过夜，次晨取出。重复7 d后，检测受试者口腔中的细菌，观察分析组成变化。具体步骤：受试者分为两组（每组n=5，龋齿组和正常对照组）。①利用无菌棉条分别留取两组受试者的口腔菌液，将益生菌棉条未干预之前的一天认定为第0天；②用1 mL 0.9%氯化钠溶液将1 g冻干菌粉融化后浸润无菌棉条，使棉条充分吸收富含益生菌的液体，制备益生菌棉条；③将益生菌棉条置于两组受试者的口腔中过夜，位置为双侧下颌第一磨牙与正对颊黏膜之间的空隙，次晨取出丢弃，重复7 d；④第8天，再次利用无菌棉条留取两组受试者的口腔菌液；⑤利用16S rDNA扩增测序技术检测两组受试者益生菌棉条干预对口腔菌液中菌群的影响。C0：正常对照组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；C8：正常对照组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息；T0：龋齿组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；T8：龋齿组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息。

1.5 统计学处理方法 使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ace、Goods-coverage、PD_whole_tree指数，使用R软件（Version 2.15.3）绘制稀释曲线、等级聚类（Rank Abundance）曲线、物种累积曲线，并使用R软件进行α多样性指数组间差异分析；使用R软件绘制PCA、PCoA和NMDS图。PCA分析使用R软件的ade4包和ggplot2软件包，PCoA分析使用R软件的WGCNA，stats和ggplot2软件包，NMDS分析使用R软件的vegan软件包。同时使用R软件进行α和β多样性指数组间差异分析，分别进行参数检验和非参数检验，2组间比较采用t检验或Wilcox检验，多于2组选用Tukey检验或agricolae包的Wilcox检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 通过棉条采集的菌液可以有效反映口腔菌群组成与功能 将正常对照组受试者A/B分别通过唾液采集器及无菌棉条采集的唾液，根据聚类得到操作分类单位（operational taxonomic units, OTUs）结果和研究需求，对棉条唾液及液体唾液进行均一化处理，分析液体唾液与棉条唾液之间共有、特有的OTUs。通过韦恩图发现，棉条唾液与液体唾液之间存在大量重叠的功能单位，即通过棉条采集的唾液中检测到的菌群和通过常规方式获取的唾液中检测到的菌群之间在很大一部分上是相同的，而通过棉条这一口腔菌液载体可检测到的微生物更丰富，见图2A、图2B。将样本中的功能单位按相对丰度由大到小排序得到对应的排序编号，再以OTUs的排序编号为横坐标，OTUs中的相对丰度为纵坐标，将这些点用折线连接，绘制得到Rank Abundance曲线。从曲线可以看出，通过棉条获取的口腔菌液相比于通过常规方式获得的口腔菌液有更好的物种丰度和均匀度。见图2C和图2D。

图2 基于OTUs的韦恩图（A、B）和Rank Abundance曲线（C、D）

为进一步分析两种方式获取的口腔菌液之间的菌群构成差异，我们比较了两标本中基于属水平物种丰度排名前10 的菌类。通过对比发现，通过棉条获得的口腔菌液与通过唾液采集器采集的唾液之间菌群构成相似，如受试者A都是以链球菌属（Streptococcus）为主要占比菌属，而受试者B则都是以嗜血杆菌属（Haemophilus）为主要占比菌属，但是棉条唾液中相对可测的微生物较液体唾液更完整，表明通过棉条收集的唾液可以更直观地反映口腔菌群的组成。见图3A和图3B。

图3 基于属水平的最大丰度排名物种柱状图

除此之外，我们检测了两种方式获得的口腔菌液的短链脂肪酸浓度，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸，见表1。作为细菌最为丰富且常见的代谢产物，短链脂肪酸浓度可以直接反映菌群的代谢活跃程度，从而从另一方面提示了菌群的功能。通过棉条获取的口腔菌液，相比于通过唾液采集器收集的菌液，拥有更为丰富的短链脂肪酸丰度，尤其体现在乙酸和丙酸这两种特殊的短链脂肪酸上。

表1 不同采集方式下唾液中短链脂肪酸含量（μg/mL）

2.2 通过棉条采集的菌液可以体现龋齿患者与正常受试者之间的口腔菌群差异 根据韦恩图所示，龋齿组患者与正常对照组患者之间在OTUs上存在差异。在干预之前，两组患者享有539个共同的功能单位，龋齿组患者的功能单位总数（OTUs=742）略多于正常对照组（OTUs=722），见图4A。而在干预之后，两组之间共同的功能单位减少为503个，并且正常对照组的菌群功能单位数目（OTUs=812）明显多于龋齿组中的功能单位总数（OTUs=616），见图4B。由此可见，龋齿患者与正常受试者之间的口腔菌群在数量上是不同的。

另外，我们选取并分析了龋齿组和正常对照组受试者基于属水平最大丰度排名前10的物种发现，两组在口腔菌群的菌属组成类别相似，但是在组成丰度方面存在一定的差异。在未进行干预之前，两组受试者都是以链球菌属（Streptococcus）为主要组成菌属，其次为嗜血杆菌属（Haemophilus）、变形菌属（Prevotella），但是链球菌属在龋齿患者中的占比明显高于对照组中，而变形菌属在龋齿组的占比则明显低于对照组，见图4C。对样本的菌群同样进行了物种差异性显著分析。通过α多样性分析中的LEfSe分析发现，在龋齿组和正常对照组之间，普氏菌（Prevotellaceae）差异有统计学意义（P＜0.05），见图4D。

图4 龋齿组与正常对照组之间物种差异

2.3 益生菌棉条可以干预口腔菌群组成 通过韦恩图对所有样本进行均一化，发现益生菌棉条干预前后的口腔菌群存在功能单位的差异。正常对照组干预之后的菌群OTUs较干预之前上升，而龋齿组干预后的口腔菌群OTUs相较于干预之前有所减少，见图5A和图5B。基于α多样性的物种分析提示对照组及龋齿组在干预之前样本中的物种总数差异无统计学意义（P＞0.05），但通过益生菌棉条干预之后，发现正常对照组与龋齿组之间的物种总数差异有统计学意义（P＜0.05），见图5C。Shannon指数提示益生菌棉条干预前后的正常对照组（C0-C8）与龋齿组（T0-T8）均存在显著的物种差异（P＜0.05），见图5D。

我们进一步通过t检验对样本中的物种进行了基于属水平的统计学比较。益生菌棉条干预之后，正常对照组马赛菌属（Massilia）及节杆菌属（Arthrobacter）显著升高（P＜0.05），毛螺旋菌属（Lachnospiraceae_NK4A136_group）显著降低（P＜0.05）；而在龋齿组中，泛菌属（Pantoea）及嗜二氧化碳噬细胞菌属（Capnocytophaga）在益生菌棉条干预之后显著升高（P＜0.05）。利用LEfSe分析对组间的物种丰度数据通过秩和检验的方法来检测不同分组间的差异物种并通过线性判别分析（linear discriminant anlysis, LDA）实现降维从而评估差异物种的影响大小，得到LDA值，绘制差异物种的LDA值分布柱状图。我们分析了LDA值大于设定值（默认设置为4）的物种，即组间差异有统计学意义的标志物。通过益生菌棉条干预，正常对照组中变形杆菌和丙型变形杆菌显著升高，反之，厚壁菌（Firmicutes）显著降低，见图5E；而在龋齿组中，干预之后的菌群相较于尚未干预的菌群，黄杆菌（Flavobacteriales）显著升高，见图5F。

图5 益生菌棉条干预之后的龋齿组和正常对照组物种差异

3 讨论

目前，临床上研究口腔微生态系统的方式包括牙菌斑、漱口水、唾液采集器等多种方法，但都存在一定的局限性。如唾液采集器或者使用漱口水采集唾液，由于受试者口腔暴露容易影响口腔微生态环境，且最终研究结果极易受唾液供者的口腔唾液分泌条件影响，因此无法客观、准确地反映真实的口腔微生态情况；牙菌斑的局部内环境及菌群的构成较为稳定，能更好地反映口腔的微生态情况，因此被广泛应用于临床试验，但是牙菌斑的供给量较少，对提取技术的要求较高，大大局限了后续的进一步研究。因此，目前亟需一种简易、稳定且精确的提取并干预口腔微生态的方式。

口腔前庭沟过去常被作为口腔局麻常用的穿刺及手术切口部位[11]，目前鲜见研究报道其在口腔原生态提取及干预方面的应用。本研究以棉条作为载体充分检测并比较了样本中的物种信息，确定了通过口腔前庭沟采取口腔菌液方法的优势。结果表明，棉条采集与常规方式采集的菌液中菌群组成相似，但前者的菌群丰度更高、均一度更好，并且具有更加丰富的短链脂肪酸含量。短链脂肪酸作为菌群发酵食物产生的最常见的代谢产物[12]，被广泛应用于微生物相关研究中。以乙酸和丙酸为代表的短链脂肪酸，不仅代表了菌群的生理活跃程度，而且在调节宿主代谢、免疫系统和细胞增殖等方面发挥了重要的作用[13-14]。研究结果中健康志愿者棉条提取唾液中的高浓度短链脂肪酸，不仅反映了该新型方法对口腔相关菌群的有效收集，更反映了宿主的健康口腔环境。

作为与口腔菌群最直接且密切相关的疾病，我们进一步探索了该方法在提取龋齿患者口腔菌群特点信息的有效性。最近一项对龋齿儿童和健康儿童的口腔菌群进行的宏基因组分析发现与健康儿童相比，龋齿儿童口腔菌群结构明显改变，其中普氏菌、卫星沙特尔沃思氏菌、成双厌氧球形菌等丰度显著升高[15]。在此之前，格氏链球菌、血链球菌、变异链球菌等链球菌属成员被广泛认为是致龋微生物，在龋齿患者中拥有较高的水平[16-17]，这与本研究利用棉条研究口腔菌群情况后得出的结论类似。本研究比较了棉条唾液提取条件下龋齿患者与正常对照组之间的口腔菌群组成情况，结果提示龋齿患者中普氏菌显著升高，而链球菌属在口腔中可测菌群中的占比也明显升高。因此，本研究认为，通过棉条提取的口腔菌液良好地传递了龋齿患者与健康者之间的口腔菌群差异信息。

益生菌作为目前常用的微生态制剂，可显著调节口腔菌群的组成[18]。我们利用益生菌联合棉条，制备益生菌棉条，延长了益生菌在口腔中停留的时间，从而举例说明了口腔前庭沟这一特殊解剖部位在干预口腔原生态方面的应用前景。相比于益生菌棉条干预之前，干预之后的口腔菌液在物种丰度、物种组成方面都发生了显著的变化，而且龋齿患者和健康志愿者在变化趋势方面也存在差异。但是，这种变化对宿主的影响是朝向怎样的方向发展、这种变化的效应大小以及这种影响的持续时间即长期效应尚需进一步探讨。

本研究表示，通过棉条获取的菌液不仅可以有效反映口腔菌群的组成及功能，并且益生菌棉条可以显著干预口腔微生态环境，从而说明口腔前庭沟的利用是一种新颖的、可有效采集并显著干预口腔原生态的方法，这对于发掘并推广更简单且高效的口腔保健方式、进一步探索口腔菌群在口腔乃至全身相关疾病中的机制具有现实意义。