环境压力对益生菌冲剂活性的影响

莫景康 黎绍基

摘 要：为了解益生菌冲剂中的益生菌对环境压力的耐受性，本研究测定了市面上3种不同品牌的益生菌冲剂（A、B、C）所含益生菌在不同胆盐浓度、不同盐酸pH值、不同H2O2浓度下的耐受能力。结果表明，12 h内3个产品在最高胆盐浓度（0.4%）中的活性均表现优秀；在pH＜6.5时，随着pH值的升高3个产品的活性均呈现递增趋势；在H2O2浓度低于0.013 3%时，随着H2O2浓度的升高A、B、C产品活性均呈现递减趋势。并在0.01% H2O2浓度下继续培养48 h后，发现C产品对H2O2有较强的适应能力，能在该浓度下成功生长繁殖。本研究的结果可为进一步推进相关标准的建立提供依据，也为开发更好的益生菌产品提供参考。

关键词：益生菌；耐受性；存活率

Effect of Environmental Stresses on the Activity of Probiotic Granule Products

MO Jingkang， LI Shaoji*

（Guangzhou College of Technology and Business， Guangzhou 510000， China）

Abstract： In order to evaluate the tolerance of probiotic granule products against different environmental stresses， viability of three commercial probiotic granule products （designated as A， B and C） exposed to bile salt， HCl and H2O2 were measured as salt， acid and oxidative stresses， respectively. Within 12 h， the activities of products A， B and C under the highest bile salt concentration of 0.4% were not affected. At pH＜6.5， the activities of all the three products showed an increasing trend with the increase of pH. When the concentration of H2O2 was lower than 0.013 3%， the activities of all the three products decreased with the increase of H2O2 concentration. During 48 h of continuous culture at the concentration of 0.01% H2O2， product C showed strong adaptability to H2O2 and could grow and reproduce successfully at this concentration. The results can provide a valuable reference for future establishment of relevant food standards and development of even better probiotic products.

Keywords： probiotics; tolerance; survival rate

益生菌是指寄生在人體内，与人体形成共生关系并对人体健康有利的微生物。常见的益生菌有乳杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌以及球菌等[1]。益生菌能在宿主肠道内定植并产生乳酸、细菌素和过氧化氢等物质，抑制肠道内的有害微生物，促进宿主肠道健康。目前，它们被广泛应用于食品和医药领域[2-3]。

益生菌在食品生产过程中和进入消化道后都可能经历各种环境压力，因此良好的环境压力耐受性对益生菌至关重要。靳志强等[4]采用MRS培养基模拟胃酸环境以及胆盐环境，分离提取出一种可以承受pH=3的环境以及胆盐浓度为0.3%的环境的植物乳杆菌。李利等[5]从酸奶中分离出的2株乳杆菌具有优良的抗酸性以及抗胆盐能力。李一娟等[6]发现从健康家禽新鲜粪便中分离出来的罗伊氏乳杆菌在经过pH=2.5、1.5 g·L-1胆盐以及1 mmol·L-1 H2O2接种处理6 h后，活菌数基本能维持初始浓度。

为了解市面上的益生菌冲剂所含的益生菌在不同环境压力下的活性，本研究以市场上在售的3种益生菌冲剂产品为研究对象，检验其中的益生菌对酸、胆盐以及抗氧化性压力的耐受性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将有效期内的3种益生菌冲剂产品（表1）接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养活化，每24 h传代。实验时将OD在0.5～1.0的3种细菌培养液在

4 000 r·min-1离心10 min，离心后去掉上清液，用生理盐水悬浮，重复以上离心、悬浮、离心，然后将菌体悬浮于新鲜的MRS液体培养基中，使OD≈1.0待用。

MRS固体培养基和猪胆盐购自北京奥博星生物技术有限公司，过氧化氢溶液购自厦门安永博科技有限公司，MRS液体培养基购自杭州百思生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对环境压力条件筛选

借鉴袁琨等[7]实验方法，将OD≈1.0的3种产品的益生菌用胆盐、酸和过氧化氢处理，具体浓度如下，每个处理重复3次。A：胆盐浓度0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%（w/v）；B：pH值为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和6.5；C：H2O2浓度0%、0.003 3%、0.006 7%、0.010 0%、0.0133%（v/v）；37 ℃恒温培养12 h，测量3种益生菌产品在600 nm的OD值。

1.2.2 环境压力耐受能力测定

借鉴袁琨等[7]实验方法，将OD=0.5～1.0的3种产品培养液按上述方法清洗并悬浮于MRS中，使OD≈1.0，立刻对菌液进行以下4种处理，每个处理重复3次。A：0.3%胆盐作为胆盐压力；B：pH值为2作为酸性压力；C：0.01% H2O2作为氧化压力；D：无压力的对照。菌液在37 ℃培养，在第4 h、8 h、12 h、24 h和48 h测OD。以时间为横坐标，以OD为纵坐标作各压力组和对照组的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 无环境压力下生长情况

由图1知，在无压力环境中，A、C产品益生菌在24 h时菌落达到稳定期并持续到48 h。而B产品益生菌在24 h时正处于稳定期，在48 h时进入衰亡期。

2.2 耐胆盐能力

在12 h内，3种产品对不同胆盐浓度的适应能力都较强，在0.4%胆盐浓度下3种产品都能成功繁殖生长。其中在0.1%胆盐浓度下A、C产品益生菌耐受能力优于无胆盐对照组，在0.4%胆盐浓度下B产品益生菌耐受能力优于无胆盐组（图2）。依据此结果，选取0.3%胆盐浓度用于动态活性研究。

3种产品在0.3%胆盐浓度下培养48 h的动态活性如图3所示。3种产品在4 h测定时菌落总数已经达到顶峰，往后开始进入衰亡期。与无压力对照组相比可以看出，0.3%浓度胆盐对3种产品的菌株都具有较强的促进生长能力。

2.3 耐酸能力

在pH值为1.5～3.0培养12 h时，3种产品的益生菌均处于抑制状态，而在pH值为3.5时A、C产品益生菌能进行少量繁殖且C产品益生菌比A产品益生菌繁殖稍强，而B产品益生菌仍被抑制，无法繁殖。说明A、C产品益生菌的耐酸能力比B产品好（图4）。依据此结果，选取pH=2.0用于动态活性研究。

在pH值为2.0下，在培养的48 h内，A、B产品益生菌被全程抑制，C产品益生菌能进行少量繁殖。说明在胃酸强度的pH下（pH=2.0），3种产品益生菌的耐受能力一般（图5）。

2.4 抗氧化能力

在H2O2浓度为0.003 3%时培养12 h，对3种产品的益生菌抑制作用不明显，H2O2浓度高于0.006 7%时，3种产品益生菌生长受限。可以说明3种益生菌具有一定的抗氧化能力（图6）。依据此结果，选取0.010 0% H2O2浓度用于动态活性研究。

在0.010 0% H2O2中的动态生长情况如图7所示。3种益生菌冲剂所含益生菌在0.010 0%固定浓度的H2O2中培养48 h，A、B产品的益生菌全程被抑制，无生长。而C产品益生菌在48 h监测时，发现成功繁殖并达到最高菌落浓度。

3 结论

3种益生菌产品在胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%和0.4%下均能保持活性，且A和C产品在0.1%的浓度下出现益生菌生长速度超过无压力对照组的情况，说明低浓度胆盐能促进部分益生菌产品的生长繁殖。在pH值低于3.5时，3种产品的益生菌生长活性受限，无法大量繁殖，说明3种益生菌产品耐酸性一般。使用低浓度的H2O2处理后，发现3种益生菌在低浓度的H2O2（0.003 3%）浓度下能进行生长繁殖，可以说明3种益生菌产品都有一定的抗氧化性能。如何提高产品益生菌的耐消化活性，是各个厂家研发人员需要重点解决的问题。对益生菌冲剂产品的探究，能为市场监管部门提供数据支撑，帮助研发人员更好地开发该类产品。

参考文献

[1]谢莉敏，李丹，程秀芳，等.益生菌及其在药学研究中的应用[J].药学研究，2013，32（4）：238-240.

[2]REID G.Probiotics： definition， scope and mechanisms of action[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2016，30：17-25.

[3]许宁宁，余梓涵，刁世童，等.益生菌在代谢综合征中的潜在作用及研究进展[J].重庆医学，2019，48（13）：2297-2300.

[4]靳志强，王延祥，李平兰，等.植物乳杆菌耐酸耐胆盐的体外试验及其降胆固醇作用[J].中国食品学報，2009，9（5）：24-28.

[5]李利，孔丽，张宁，等.耐酸耐胆盐乳酸菌的鉴定及筛选[J].食品科学，2015，36（21）：123-128.

[6]李一娟，邵开生，张娜，等.产Reuterin罗伊氏乳杆菌的定向筛选及其生物学特性[J].食品科学，2021，42（14）：32-38.

[7]袁琨，沈昊阳，贾东芬，等.基于生长时间光谱法的大肠菌群快速检测仪器的设计[J].中国计量大学学报，2018，29（3）：345-350.