硼替佐米对人甲状腺癌细胞凋亡侵袭及AMPK/mTOR/4EBP1通路的影响

贺椿媛， 梁金环， 王 翠， 徐 倩

(沧州医学高等专科学校基础医学部生物化学教研室， 河北 沧州 061000)

甲状腺癌(thyroid carcinoma，TC)是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，包括分化型甲状腺癌(乳头状癌、滤泡状癌)、甲状腺未分化癌和甲状腺髓样癌[1]。近年来，其发病率逐渐升高，且女性患者居多；临床治疗方法仍以手术治疗为主，放、化疗为辅的综合模式治疗，但晚期分化型、未分化型甲状腺癌对临床常用的放化疗治疗敏感度较差，且对患者的生存率并无明显提高[2]，故寻找更佳的治疗手段为临床研究的重点。硼替佐米(Bortezomib)是一种蛋白酶体抑制剂，在治疗难治性或复发性骨髓瘤、淋巴瘤以及某些实体肿瘤中具有令人瞩目的疗效[3]，最近，一项局部晚期或转移性甲状腺髓样癌的临床Ⅰ/Ⅱ期试验研究显示，硼替佐米在治疗中具有安全性和耐受性好的特点[4]；体外研究也显示硼替佐米可诱导TC细胞凋亡[5]，是尚无确定治疗方案的TC患者的一种有前途的治疗方法。然而，关于硼替佐米在甲状腺癌中的作用的报道很少。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路的激活与甲状腺肿瘤细胞凋亡和细胞周期停滞密切相关[6,7]，而硼替佐米可诱导AMPK激活，进而诱导骨髓瘤细胞、人结肠癌细胞凋亡和自噬[8,9]；硼替佐米对TC细胞凋亡的诱导作用是否与AMPK/mTOR通路有关还未知，因此本研究以TC细胞为对象，探究硼替佐米对人TC细胞凋亡、侵袭的影响及潜在的作用机制；以明确硼替佐米的具体作用机制，从而为硼替佐米应用于甲状腺癌治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1细胞:人甲状腺乳头状癌细胞株B-CPAP(美国ATCC)购自上海子实生物科技有限公司，货号：os100407。在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，隔天换液，每2-3d传代一次，在细胞达到指数增长期时开始实验。

1.2主要试剂与仪器:注射用硼替佐米(万珂，意大利BSP Pharmaceuticals SRL，分包装：西安杨森制药有限公司，批准文号：国药准字J20171067)；Compound C(AMPK抑制剂，美国TargetMo，货号：S7840)；AICAR(AMPK激活剂，碧云天生物科技公司，货号：S1515)；胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI 1640培养基均购自美国GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；人工重构基底膜胶(Matrigel)(美国BD公司，货号：356234)；Transwell小室(美国Corning公司，货号：3413)；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒(C0009S)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA试剂盒(P0010)均购自碧云天生物科技公司；AMPK(ab32047)、p-AMPK(ab133448)、mTOR(ab32028)、p-mTOR(ab109268)、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)(ab2606)、p-4EBP1(ab278686)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)(ab196495)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspases-3)(ab184787)、E-钙黏连蛋白(E-cadherin)(ab133597)、β-连接素(β-catenin)(ab32572)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)均购自英国abcam公司。细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；倒置荧光显微镜(IX73，日本Olympus公司)；多功能酶标仪(iMark680)、流式细胞仪(FACSCanto Ⅱ)、蛋白转膜装置购自美国Bio-Rad公司。

1.3方 法

1.3.1MTT法筛选硼替佐米的实验浓度及时间:取指数增长期的甲状腺癌B-CPAP细胞，以2×103细胞/孔的浓度接种到96孔板中(边缘孔用PBS填充)，待细胞贴壁并铺满孔底后，弃去原培养基，更换含低浓度(2%)血清的培养基饥饿培养24h后，加入含不同浓度硼替佐米(0、12.5、25、100、200nmoL/L)的培养基继续培养24、48h。然后在各孔中加入5g/L MTT试剂20μL；继续培养4h，弃上清后加入150μL的DMSO；在490nm处测定各组细胞的OD值，将不含细胞的培养基作为空白对照组，计算细胞存活率；并采用GraphPad软件计算硼替佐米对细胞的半数抑制浓度(the half inhibitory concentration,IC50)。细胞存活率=(实验组OD-空白对照组OD)/(对照组OD-空白对照组OD)×100%

1.3.2流式细胞术检测细胞凋亡:取指数增长期的甲状腺癌B-CPAP细胞，按每孔2×106个接种于24孔板，分为对照组、AICAR组(AMPK激活剂2mmoL/L)[10]、硼替佐米(50nmoL/L)组、硼替佐米+Compound C组(硼替佐米 50nmoL/L+AMPK抑制剂Compound C 5μmoL/L)[7]；给予相应的处理后在37℃的5% CO2培养箱中继续培养48h。培养48h后，胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/mL，EP管中加入100μL单细胞悬液，然后加入Annexin V-FITC和PI各5μL，避光孵育15min后加入1×Blinding Buffer 400μL，1h内使用流式细胞仪检测各组B-CPAP细胞凋亡率。

1.3.3Transwell实验检测细胞侵袭能力:细胞按照1.3.2项下操作步骤进行分组和培养，取培养48h后的各组B-CPAP细胞，用无血清的细胞培养液调整细胞浓度为5×104个/mL，将Matrigel胶稀释后加到Transwell上室，风干过夜后，分别加入200μL细胞悬液(无血清)，下室加入400μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h，取出Transwell小室，95%乙醇固定，0.1%结晶紫染液染色，ddH2O清洗小室下表面，用湿棉签小心擦除上室底部膜表面的细胞。晾干后在显微镜下随机取3个视野，拍照；取细胞穿膜数，计算平均值表示细胞侵袭能力。

1.3.4Western Blot检测细胞凋亡、侵袭以及AMPK/mTOR/4EBP1通路相关蛋白的表达:使用RIPA裂解液提取各组细胞中蛋白质，BCA试剂盒测量上清液中的总蛋白浓度。取等量蛋白质样品(30μg)上样，然后在SDS-PAGE上进行电泳分离，并将其转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭，并在4℃下与一抗(AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、Bcl-2、Caspases-3、E-cadherin、β-catenin、β-actin)孵育过夜。第2天，洗去一抗，加入二抗(IgG)孵育2h，然后使用化学发光试剂盒(ECL)进行显色。以β-actin为内参，分析结果。

2 结 果

2.1硼替佐米的体外细胞实验浓度:不同浓度的硼替佐米能不同程度的抑制B-CPAP细胞的生长，见表1；不同浓度的硼替佐米在培养24h时，与对照组相比，细胞存活率差异不甚明显；不同浓度的硼替佐米在培养48h时，与对照组相比，细胞存活率显著降低，硼替佐米对B-CPAP细胞的IC50为53.21nmoL/L，因此，选择50nmoL/L的硼替佐米作用48h作为后续实验浓度和时间。

表1 硼替佐米对B-CPAP细胞活力的影响±s，%，n=3)

2.2各组甲状腺癌B-CPAP细胞凋亡率:与对照组相比，AICAR组和硼替佐米组B-CPAP细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与AICAR组相比，硼替佐米组细胞凋亡率无明显统计学差异(P>0.05)；与硼替佐米组相比，硼替佐米+Compound C组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；见图1、表2。

图1 各组B-CPAP细胞凋亡检测结果

表2 各组B-CPAP细胞凋亡率的比较±s，%，n=3)

2.3各组甲状腺癌B-CPAP细胞侵袭能力:与对照组相比，AICAR组和硼替佐米组B-CPAP细胞进入Transwell小室下层的数量显著降低(P<0.05)；与AICAR组相比，硼替佐米组B-CPAP细胞进入Transwell小室下层的数量无明显统计学差异(P>0.05)；与硼替佐米组相比，硼替佐米+Compound C组B-CPAP细胞进入Transwell小室下层的数量明显增加(P<0.05)；见图2、表3。

图2 各组B-CPAP细胞的侵袭能力

表3 各组B-CPAP细胞侵袭能力的比较±s，个，n=3)

2.4各组甲状腺癌B-CPAP细胞凋亡、侵袭相关蛋白的表达:与对照组相比，AICAR组和硼替佐米组B-CPAP细胞Caspases-3、E-cadherin、β-catenin的表达显著增加，Bcl-2的表达显著降低(P<0.05)；与AICAR组相比，硼替佐米组B-CPAP细胞上述蛋白表达量无明显统计学差异(P>0.05)；与硼替佐米组相比，硼替佐米+Compound C组B-CPAP细胞Caspases-3、E-cadherin、β-catenin的表达明显降低，Bcl-2的表达明显增加(P<0.05)；见图3、表4。

图3 各组甲状腺癌B-CPAP细胞凋亡、侵袭相关蛋白的表达

表4 各组B-CPAP细胞凋亡侵袭相关蛋白的表达比较±s，个，n=3)

2.5各组甲状腺癌B-CPAP细胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相关蛋白的表达:与对照组相比，AICAR组和硼替佐米组B-CPAP细胞p-AMPK/AMPK的比值显著增加，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值显著降低(P<0.05)；与AICAR组相比，硼替佐米组B-CPAP细胞上述蛋白表达量无明显统计学差异(P>0.05)；与硼替佐米组相比，硼替佐米+Compound C组B-CPAP细胞p-AMPK/AMPK的比值明显降低，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值明显增加(P<0.05)；见图4、表5。

图4 各组甲状腺癌B-CPAP细胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相关蛋白的表达

表5 各组B-CPAP细胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相关蛋白的表达比较±s，n=3)

3 讨 论

硼替佐米是一种人工合成的双肽基硼酸盐二肽化合物，具有抗增殖和抗肿瘤活性，可诱导细胞周期停滞和凋亡；已被批准用于难治性/复发性多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的治疗。罗雨等[11]发现硼替佐米可抑制甲状腺未分化癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡；Tsumagari等[5]的研究表明硼替佐米和BRAF抑制剂维拉非尼联合使用，在体外和体内均可诱导甲状腺癌细胞生长抑制、G2期细胞周期阻滞和细胞凋亡增加，并使甲状腺癌细胞对BRAF抑制剂敏感。E-cadherin普遍存在于各类上皮细胞中，通常与β-catenin形成E-钙黏附蛋白/连接蛋白复合体，从而介导上皮细胞间的黏附。当E-cadherin、β-catenin表达减低或缺失会使肿瘤细胞间的黏附性减弱，易于脱离和迁移，侵入周围组织和血管。本研究结果显示，硼替佐米可显著降低甲状腺癌B-CPAP细胞的存活率和Bcl-2的表达，增加E-cadherin、β-catenin、Caspases-3的表达，促进其凋亡；与以上研究结果一致，提示硼替佐米具有抑制甲状腺癌细胞的增殖、侵袭，促进凋亡的作用。

在甲状腺癌的发病过程中，某些基因发生突变或移位、甲基化等异常时，会通过激活相关的信号通路导致细胞异常增殖或者凋亡，导致癌变。研究发现在甲状腺乳头状癌组织中p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的阳性率显著高于癌旁正常组织，且4EBP1、S6K1为mTOR下游信号分子，在癌组织中异常表达，提示三者与甲状腺乳头状癌的发生发展有密切关系[12]。AMPK是细胞内能量稳态的关键调节剂，除了在调节正常细胞代谢中起至关重要的作用外，越来越多的证据表明，在某些癌症中，AMPK活性的抑制或丧失可能会增强某些肿瘤细胞生长和增殖的致癌信号通路。本研究结果显示，在甲状腺癌B-CPAP细胞中p-AMPK/AMPK的比值较低，而使用AMPK的激活剂AICAR可明显增加p-AMPK/AMPK的比值，促进B-CPAP细胞凋亡。AMPK是mTOR通路的负调节剂，AMPK的活化可抑制mTOR的激活，进而抑制4EBP1磷酸化，从而抑制蛋白质合成。Zhou等[13]发现抑制AMPK/mTOR信号通路的激活，可增强甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭；而使用双重AMPK激活剂/mTOR抑制剂可显著抑制甲状腺癌细胞的生长[14]。以上研究表明，AMPK的激活对抑制甲状腺乳头状癌的发生发展至关重要。而硼替佐米可诱导AMPK磷酸化，并且AMPK敲低减弱了硼替佐米的保护作用，表明AMPK激活是硼替佐米作用的基础[15]。本研究发现给予硼替佐米干预后，B-CPAP细胞中p-AMPK/AMPK的比值明显增加，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值降低，而使用AMPK抑制剂Compound C可升高p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值，明显减弱硼替佐米对甲状腺癌B-CPAP细胞的促凋亡作用，提示硼替佐米可能通过激活AMPK，抑制mTOR和4EBP1的活化，诱导甲状腺乳头状癌细胞凋亡。

综上所述，硼替佐米可抑制人甲状腺癌细胞增殖、侵袭，并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与激活AMPK，抑制mTOR和4EBP1的活化有关。本研究仅从体外细胞水平上初步探究了硼替佐米对人甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞的影响，由于体内外肿瘤微环境存在差异，尚需要进行体内动物实验进一步明确硼替佐米对人甲状腺癌细胞的作用；此外，在甲状腺滤泡状癌、甲状腺未分化癌和甲状腺髓样癌中硼替佐米是否发挥同样的作用，有待研究确认。