消瘤胶囊对人肝癌耐药细胞株Bel/Fu化疗敏感性的影响*

林小玲，柯维强，唐文军，闫其星

海南医学院第二附属医院，海南 海口 570311

肝癌为常见恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤中发病率排名第5，病死率第2[1]。我国肝癌发病率呈现逐年上升趋势[2]。肝癌早期较为隐匿，诊断率较低，大多患者确诊时已为晚期。由于肝癌具有恶性程度高、转移性强等特点，往往导致预后不良，给患者带来沉重负担[3]。化疗作为肝癌治疗的重要手段，可有效抑制癌细胞增殖。化疗药物可以通过干扰细胞DNA合成与代谢、抑制细胞分裂等方式，对肿瘤细胞产生毒性，诱导癌细胞死亡[4]。而癌细胞多药耐药性导致化疗药物在临床使用上的效用受限。因此，解决细胞耐药性在肝癌临床治疗中尤为重要。消瘤胶囊主要由黄芪、白芍、郁金等中药组成。研究表明，黄芪和白芍均可增强肝癌细胞化疗敏感性[5-6]。因此，本研究探讨消瘤胶囊对肝癌耐药细胞株Bel/Fu的化疗敏感性。

1 材料

1.1 细胞细胞株Bel/Fu(上海酶联生物科技有限公司，货号：19-0615-012)。

1.2 药物与试剂消瘤胶囊(江苏省中医药研究院自制，组方：海藻15 g，斑蝥30 g，黄芪15 g，郁金10 g，党参15 g，丹参20 g，夏枯草15 g，白芍10 g，白花蛇舌草30 g，三棱13 g，仙鹤草15 g，土鳖虫10 g，批号：190524)；5-氟尿嘧啶注射液(南通精华制药股份有限公司，批号：190413)。细胞完全培养基(美国Gibco公司，货号：GI014256)；四唑盐(MTT)细胞增殖检测试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司，批号：20190623)；二甲基亚砜(美国Sigma公司，货号：T102146)；40 ng·L-1多聚甲醛(南京高和化工有限公司，货号：G146138)；磷酸盐缓冲液(PBS)(上海实验试剂公司，货号：PGE3002)；荧光淬灭剂、荧光预混试剂(碧云天生物技术有限公司，货号：236159、315698)；TdT反应液、dNTP、ddH2O均购自[宝生物(大连)科技有限公司，批号：20190412、20190523、20190511]；原位末端标记技术(TUNEL)检测试剂盒(美国AAT Bioquest公司，批号：190821A)；RNA提取、逆转录试剂盒(德国QIAGEN公司，批号：190416、191024)；引物合成委托苏州泓迅生物科技股份有限公司；细胞裂解液(北京百奥莱博科技有限公司，货号：C236105224)；谷胱甘肽 S-转移酶-π(glutathione S-transferase-π，GST-π)、p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)、β-actin 一抗及二抗(HRP)(美国Abcam公司，批号：20190221、20190420、20190618、20190316)。

1.3 仪器5417R型离心机(德国Eppendorf公司)；HERAcell 240i型细胞CO2培养箱(美国Thermo公司)；CX43型光学显微镜(日本Olympus公司)；YKY-1200型荧光倒置显微镜(上海永科光学仪器有限公司)；Infinite M100 Pro型酶标仪(美国TECAN公司)；LineGene 9600 Plus型聚合酶链反应(PCR)扩增仪(日本Ferrotec公司)；JY-SCZ2型电泳槽(北京六一仪器厂)；E-Gel Power Snap型凝胶电泳仪(美国Thermo公司)；170-3940型转膜仪(美国Bio-Rad公司)；Innova S41i型摇床(美国Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 细胞培养用含体积分数10%胎牛血清的细胞完全培养基培养人肝癌耐药Bel/Fu细胞，将其置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，当细胞融合达80%时接种于6孔板中，并随机分为4组：空白对照组、5-氟尿嘧啶组(12.5 mg·L-1)、消瘤胶囊组(25 g·L-1)、联合用药组(12.5 mg·L-15-氟尿嘧啶+25 g·L-1消瘤胶囊)，每组设置6个复孔。各组培养基中加入相应浓度的药物，空白对照组加入等体积细胞培养基，培养48 h。

2.2 观察细胞形态给药结束后，在光学显微镜下观察各组细胞状态。

2.3 MTT法检测细胞增殖抑制率将细胞接种于96孔板中培养，加入0.5% MTT反应液，将细胞置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中继续培养4 h。弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，于摇床孵育 10 min 后，使用酶标仪在570 nm处读出各样本孔光吸收值(OD)。

细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%

2.4 检测细胞凋亡率给药结束后，通过TUNEL法检测细胞凋亡指数。收集细胞，将细胞涂片后自然晾干，在40 ng·L-1多聚甲醛溶液中浸泡固定 1 h，PBS漂洗后，将样本浸入3%H2O2中封闭 30 min，PBS漂洗后，将样本浸入含有1% Triton-X-100的PBS溶液中通透30 min，PBS漂洗后，向样品上滴加50 μL TdT反应液，避光孵育1 h，PBS漂洗后，加入50 μL染色液，避光孵育30 min，PBS漂洗后，使用DAPI对细胞核进行复染，PBS漂洗后，滴加荧光淬灭剂封片并在荧光显微镜下观察。每个样本随机挑选3个视野，统计凋亡阳性细胞数和视野中总细胞数。

细胞凋亡率(%)=(阳性细胞数/总细胞数)×100%

2.5 RT-PCR法检测细胞GST-πmRNA、p-gpmRNA水平给药结束后，收集细胞至离心管中，加入Trizol提取细胞总RNA，并将RNA逆转录为cDNA。根据NCBI GeneBank中查找GST-π、p-gp 和β-actin mRNA序列设计出上下游引物。GST-π上游引物：5′-TAGACTCTTAGATCAGCTAGA-3′，下游引物：5′-GATGACCTATAGCCTAGTAC-3′，产物长度131 bp；p-gp上游引物：5′-TAGCTGCAACTAGCCGATACA-3′，下游引物：5′-CAATCGTAGCTAGGCCTAGA-3′，产物长度 106 bp；β-actin上游引物：5′-CTTAGCTGCATCGATGCTCT-3′，下游引物：5′-GCTAATACGCTAGCTAACGA-3′，产物长度114 bp。反应体系：cDNA0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，荧光预混试剂0.5 μL，dNTP 0.5 μL，ddH2O 7.5 μL。设置退火温度57 ℃，40个循环，以β-actin为内参，按照2-△△Ct计算出目的基因的相对表达量。

2.6 Western Blot法检测细胞GST-π、p-gp、gp蛋白表达给药结束后，收集细胞至离心管中，加入细胞裂解液，4 ℃摇床孵育过夜，10 000×g4 ℃离心 10 min，上清即为细胞总蛋白，加上样缓冲液，沸水中煮5 min。蛋白上样，进行凝胶电泳，转膜，使用体积分数5%脱脂牛奶于摇床上室温封闭2 h，PBST清洗3次，加一抗4 ℃孵育过夜，PBST清洗3次，加二抗温孵育2 h，曝光。根据条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达。

3 结果

3.1 对人肝癌耐药细胞株Bel/Fu形态学的影响空白对照组细胞贴壁生长，细胞多表现为梭形、多角形；5-氟尿嘧啶组细胞形态正常，偶见死亡悬浮状态圆形细胞；消瘤胶囊组细胞生长抑制，部分细胞出现死亡悬浮；联合用药组细胞生长抑制严重，培养基中存在大量死亡悬浮细胞。见图1。

图1 光镜下观察人肝癌耐药细胞株Bel/Fu(×200)

3.2 对细胞增殖抑制率的影响与空白对照组比较，5-氟尿嘧啶组、消瘤胶囊组和联合用药组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05，P<0.01)；与5-氟尿嘧啶组比较，消瘤胶囊组和联合用药组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05，P<0.01)；与消瘤胶囊组比较，联合用药组细胞增殖抑制率极显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 MTT法检测细胞增殖抑制率

3.3 对细胞凋亡率的影响与空白对照组比较，5-氟尿嘧啶组、消瘤胶囊组和联合用药组细胞凋亡率显著升高(P<0.05，P<0.01)；与5-氟尿嘧啶组比较，消瘤胶囊组和联合用药组细胞凋亡率显著升高(P<0.05，P<0.01)；与消瘤胶囊组比较，联合用药组细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。见图2、表2。

图2 TUNEL法检测细胞凋亡(×100)

表2 各组细胞凋亡率的比较

3.4 对细胞GST-πmRNA、p-gpmRNA水平的影响与空白对照组比较，5-氟尿嘧啶组、消瘤胶囊组和联合用药组细胞GST-πmRNA、p-gpmRNA 水平显著降低(P<0.05)；与5-氟尿嘧啶组比较，消瘤胶囊组和联合用药组细胞GST-πmRNA、p-gpmRNA水平显著降低(P<0.05)；与消瘤胶囊组比较，联合用药组细胞GST-πmRNA、p-gpmRNA水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞GST-π mRNA、p-gp mRNA水平比较

3.5 对细胞GST-π、p-gp、gp蛋白表达的影响与空白对照组比较，5-氟尿嘧啶组、消瘤胶囊组和联合用药组细胞GST-π蛋白表达、p-gp/gp水平显著降低(P<0.05)；与5-氟尿嘧啶组比较，消瘤胶囊组和联合用药组细胞GST-π蛋白表达、p-gp/gp水平显著降低(P<0.05)；消瘤胶囊组比较，联合用药组细胞GST-π蛋白表达、p-gp/gp水平显著降低(P<0.05)。见图3、表4。

图3 各组细胞GST-π、p-gp蛋白表达

表4 各组细胞GST-π、p-gp蛋白表达比较

4 讨论

肝癌是常见高病死率恶性肿瘤，治疗常使用手术切除和化疗等方法[7]。5-氟尿嘧啶是临床常见化疗药物之一，对乳腺癌、食道癌、胃癌等均有疗效，也是治疗肝癌的最佳药物之一[8]，可通过抑制DNA合成诱导细胞凋亡。由于肝癌细胞易产生耐药性，导致5-氟尿嘧啶无法有效清除患者体内残留的癌细胞，引起癌症复发、转移等预后不良现象，最终导致治疗失败[9]。研究显示，5-氟尿嘧啶虽然有持续的抗肿瘤活性，但其活性低，癌细胞对该药物的耐药率高[10-11]。因此，如何提高癌细胞对化疗药物敏感性，成为目前研究的热点[12-14]。消瘤胶囊为复方中药，主要由黄芪、白芍、郁金、海藻、土鳖虫等组成。研究表明，消瘤胶囊对肝癌细胞有抑制作用[15]。但消瘤胶囊是否可提高耐药细胞化疗敏感性尚未见报道。因此，本研究使用人肝癌耐药细胞株Bel/Fu探讨消瘤胶囊提高耐药细胞化疗敏感性的作用。

肝癌在中医上属于“积聚”“癥瘕”“鼓胀”“暴症”等范畴[16]。治疗肝癌可通过补气健脾、培补肝肾、祛瘀解毒、扶正固本等配合辨证论治[17]。消瘤胶囊中的黄芪可补气止汗、消肿利尿；白芍可柔肝止痛、养血敛阴；郁金可活血止痛、行气解郁；海藻可软坚散结、利水消肿；土鳖虫可破血逐瘀；仙鹤草可补虚强壮、止痢解毒；僵蚕可化痰解散、平肝息风，诸药合用可发挥祛邪扶正功效[18]。本研究结果显示，消瘤胶囊可抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡，此外，消瘤胶囊与5-氟尿嘧啶联合用药效果均优于单独用药疗效，提示消瘤胶囊可抑制肝癌耐药细胞株增殖、促进其凋亡，可能与黄芪、白芍、郁金均可提高肝癌细胞化疗敏感性有关[19-21]。

GST-π属于细胞解毒系统中引起肿瘤细胞耐药的基因之一，具有转运和解毒作用[22]。GST-π可与亲脂性药物结合，增加其水溶性，促进其代谢，导致药物被降解或通过尿液排出，引起细胞耐药[23]。研究显示，在肝癌多药耐药细胞株中GST-π高表达[24]。GST-π可通过还原活性氧、灭活亲电子化合物等方式参与DNA损伤修复，最终抑制细胞凋亡。GST-π表达降低可提高癌细胞化疗敏感性，从而促进癌细胞凋亡[25]。p-gp属于ATP结合盒转运蛋白，是引起癌细胞耐药的重要机制之一，广泛存在于具有排泄和分泌功能的细胞中，减轻有害外源物质对细胞的损害，对细胞有防御的作用[26]。研究发现，肝癌细胞可通过 p-gp 将化疗药物排出细胞外，避免细胞受到化疗药物的损害，最终导致肝癌细胞耐药[27]。癌细胞耐药和细胞凋亡抑制关系密切，研究表明，p-gp还可通过抑制促凋亡基因Caspase-3，抑制细胞凋亡[28]。本研究结果显示，消瘤胶囊可降低人肝癌耐药细胞株Bel/Fu中 GST-π、p-gp蛋白表达，与5-氟尿嘧啶联合使用时，效果优于单独使用效果。报道指出，人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-116/L-OHP中GST-π、p-gp 均高表达，给予不同浓度的姜黄素均可降低其表达，促进细胞凋亡[29]；研究显示，降低结直肠癌化疗耐药癌细胞株 GST-π、p-gp表达，可增加癌细胞对化疗药物的敏感性[30]，提示通过抑制 GST-π、p-gp表达可增强人肝癌耐药细胞株Bel/Fu对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。由此可知，消瘤胶囊可能是通过该途径发挥增强人肝癌耐药细胞株Bel/Fu的化疗敏感性的作用。

综上所述，消瘤胶囊可提高人肝癌耐药细胞株Bel/Fu的化疗敏感性，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。由于化疗耐药作用机制较为复杂，有待进一步研究。