加成型硅橡胶口腔印模材料抑菌剂及其剂量筛选

郜琪臻，郎 朗，陈永凤

(1.中国医科大学附属第一医院药学部，辽宁 沈阳 110001;2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016)

口腔印模是指口腔内部组织的印模，口腔印模材料[1]在口腔修复中起着重要作用。而口腔内部是一个高度含菌的环境，在口腔诊疗操作过程中印模材料可能被患者的唾液或血液中的病原体污染，进而在医护人员间传播。因此，对口腔印模材料的抑菌操作十分关键。目前，国内外还没有一套完善的被口腔界公认的口腔印模材料的灭菌消毒方案。传统的浸泡消毒法使用戊二醛或含氯试剂对口腔印模材料进行浸泡以起到抑菌效果[2]，但浸泡消毒会造成口腔印模材料变形，破坏表面细节，消毒剂的挥发还可能对人体造成潜在的危害，且操作比较繁琐。因此，需要筛选能够加入口腔印模材料且不影响其性能的抑菌剂及其剂量[3-4]。鉴于此，作者通过评价加入不同种类及剂量的抑菌剂后加成型硅橡胶口腔印模材料的抑菌效果，筛选加成型硅橡胶口腔印模材料的最适抑菌剂及其剂量。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

加成型硅橡胶口腔印模材料，沈阳药科大学药物制剂教研室。

醋酸氯己定、苯扎溴铵、百里香酚、肉桂醛、桉叶油，天津福晨化学试剂厂。

LDZX-30KBS型高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；BHC-1300型超净工作台，苏州净化设备有限公司；DNP-9082BS-Ⅲ型恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；厌氧培养装置，青岛海博生物技术有限公司。

1.2 抑菌剂的筛选

1.2.1 细菌平板的制备

供试菌株：牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)W83、消化链球菌(P.anaerobic)BNCC23710、金黄色葡萄球菌(S.aureus)BNCC186335、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、大肠杆菌(E.coli)BNCC133264，沈阳药科大学药物制剂教研室。

供试菌株经鉴定为纯培养菌株后，用PBS缓冲液制成菌悬液，使用比浊管将细菌浓度调整为1×108CFU·mL-1。用无菌棒取菌悬液分别均匀涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、硫乙醇酸盐流体培养基及牙龈卟啉单胞菌培养基表面，置于37 ℃、湿度100%培养箱中进行培养。

1.2.2 抑菌效果的评价

分别将醋酸氯己定、苯扎溴铵、百里香酚、肉桂醛、桉叶油以1%的剂量与加成型硅橡胶口腔印模材料混匀，放入模具中固化，用打孔器制成直径10 mm、厚2 mm的圆形样片；以未加入抑菌剂的样片为空白对照。将圆形样片分别放入已均匀生长的牙龈卟啉单胞菌、消化链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌平板中，培养48 h后测量抑菌圈直径。平行测量5次，取平均值，比较5种抑菌剂的抑菌效果。

1.3 抑菌剂剂量的筛选

1.3.1 抑菌圈直径的测量

按1.2.1方法制备细菌平板，将百里香酚分别以1%、2%、3%、4%、5%的剂量与加成型硅橡胶口腔印模材料混匀，放入模具中固化，用打孔器制成直径10 mm、厚2 mm的圆形样片；以未加入百里香酚的样片为空白对照。将圆形样片分别放入已均匀生长的牙龈卟啉单胞菌、消化链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌平板中，以2%戊二醛浸泡后的样片为阳性对照，每组做3个平行；将细菌平板置于37 ℃、湿度100%培养箱中继续培养48 h或24 h后测量抑菌圈直径。平行测量5次，取平均值。采用统计软件Origin 8进行单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

1.3.2 抑菌率的测定

1.3.2.1 加成型硅橡胶口腔印模材料样片的制备

将百里香酚分别以1%、2%、3%、4%、5%的剂量与加成型硅橡胶口腔印模材料混匀，放入模具中固化，用模具制成边长(50±2) mm、厚2 mm的正方形样片；以未加入百里香酚的样片为空白对照，以2%戊二醛浸泡后的样片为阳性对照。

1.3.2.2 接种液的制备

用无菌接种环将一环预培养好的细菌转移至少量1/500营养肉汤中，将细菌分散均匀，并采用比浊卡和标准比浊管(6.0×105CFU·mL-1)使细菌浓度保持在2.5×105～10×105CFU·mL-1之间，作为接种液。

1.3.2.3 接种

将含不同剂量百里香酚的正方形样片分别置于无菌培养皿中，用移液枪吸取0.2 mL接种液，滴到每个样片表面，用40 mm×40 mm覆盖膜盖于接种液上，并向下轻轻按压使接种液向四周扩散，确保接种液不从覆盖膜边缘溢出，再盖上培养皿盖，如图1所示。

1.覆盖膜 2.接种液 3.样片 4.培养皿 5.培养皿盖

1.3.2.4 细菌回收

未加入百里香酚的样片，在培养皿中加入10 mL SCDLP培养液，对样片进行充分冲洗以回收细菌。加入百里香酚的样片，置于37 ℃、湿度100%培养箱中继续培养24 h后，重复上述操作以回收细菌。

1.3.2.5 抑菌率的计算

采用平板培养法测定活菌数。用PBS缓冲液对SCDLP回收液进行10倍梯度稀释，取SCDLP回收液及其10倍稀释液各1 mL，分别置于无菌培养皿中，每个培养皿中注入15 mL平板计数培养琼脂，轻轻搅拌以分散细菌，倒置于37 ℃、湿度100%培养箱中培养48 h，分别按式(1)、(2)计算活菌数(以1 cm2计)与抑菌率：

(1)

(2)

式中：C为2个培养皿的平均菌落数；n为稀释倍数；V为SCDLP回收液体积，mL；A为膜表面积，mm2。

2 结果与讨论

2.1 抑菌剂的选择

加入醋酸氯己定、苯扎溴铵、百里香酚、肉桂醛、桉叶油等5种抑菌剂后，仅百里香酚组在细菌平板上出现抑菌圈。百里香酚对牙龈卟啉单胞菌、消化链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑菌圈直径分别为12.35 mm、13.64 mm、16.24 mm、26.24 mm、24.36 mm。表明，百里香酚具有较强的抑菌作用，故选择百里香酚作为抑菌剂进行后续实验。

2.2 抑菌剂用量的选择

2.2.1 对常见口腔细菌的抑菌圈直径

厌氧型细菌牙龈卟啉单胞菌、消化链球菌在37 ℃、湿度100%条件下培养48 h后，需氧型细菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌在37 ℃、湿度100%条件下培养24 h后，测定抑菌圈直径，结果见表1。

对表1数据进行单因素分析，得到牙龈卟啉单胞菌F=25.13863，P=0.00076；消化链球菌F=12.07753，P=0.000034；金黄色葡萄球菌F=3.46176，P=0.05；枯草芽孢杆菌F=1.87797，P=0.19；大肠杆菌F=4.42192，P=0.025。除枯草芽孢杆菌外，其余细菌的P≤0.05，表明结果差异具有统计学意义。

表1 供试样片对常见口腔细菌的抑菌圈直径/mm

2.2.2 对常见口腔细菌的抑菌率

厌氧型细菌牙龈卟啉单胞菌、消化链球菌在37 ℃、湿度100%条件下培养48 h后，需氧型细菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌在37 ℃、湿度100%条件下培养24 h后，测定抑菌率，结果见表2。

表2 供试样片对常见口腔细菌的抑菌率/%

由表2可知，加入百里香酚的加成型硅橡胶口腔印模材料样片对常见口腔细菌均有不同程度的抑制作用，其中对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用最强，百里香酚剂量为5%时即可达到抑菌要求。

2.3 讨论

抑菌剂筛选中，仅百里香酚组出现抑菌圈，推测醋酸氯己定、苯扎溴铵未产生抑菌圈的原因是：(1)醋酸氯己定和苯扎溴铵中含有N元素，N元素通常以氨的形式存在，氨会与催化剂表面的酸性中心发生反应，减少了催化剂表面酸性中心的数量，使催化剂的金属功能与催化功能失调，进而减弱催化剂与抑菌剂的性能，且Pt的p电子轨道为空轨道，N为富电子原子会与之结合，引起Pt催化剂中毒；(2)由于辅料白炭黑的表面有硅醇基(Si-OH)，一定程度上可以与醋酸氯己定、苯扎溴铵中的胺基发生反应(酸碱中和且N的孤对电子与H+结合)。肉桂醛与桉叶油被包裹在加成型硅橡胶口腔印模材料的网状结构中不能释放，且二者皆为挥发油，在印模材料表面不能留存。

百里香酚具有杀菌作用强、毒性低的特点，对口腔、咽喉黏膜有杀菌作用，对龋齿腔有防腐、局麻作用，用于口腔、咽喉的消毒杀菌以及皮肤癣菌病、放射菌病的治疗等。百里香酚的抑菌原理为：可以改变细菌细胞膜脂肪酸的组成及含量；可以改变细菌细胞膜形态；能与细菌质粒DNA相互作用，从而使细菌细胞膜通透性改变、完整性破坏，不能进行正常的复制与转录，抑制细菌的传代与生长[5-6]。因此，可将百里香酚加入到加成型硅橡胶口腔印模材料中，以达到在与口腔组织接触的情况下抑制细菌增殖的作用。

3 结论

通过评价加入不同种类及剂量的抑菌剂后加成型硅橡胶口腔印模材料的抑菌效果，筛选加成型硅橡胶口腔印模材料的最适抑菌剂及其剂量。结果表明，加入不同种类抑菌剂的加成型硅橡胶口腔印模材料样片放入细菌平板中培养48 h后，仅百里香酚组出现抑菌圈；加入1%～5%百里香酚的加成型硅橡胶口腔印模材料样片培养后的抑菌圈直径和抑菌率整体均随百里香酚浓度的增加而增大，且对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用最强。故，选择5%百里香酚作为加成型硅橡胶口腔印模材料的抑菌剂。