不同种类中药废弃物和中药复方的体外抑菌试验

陆祖瑜 ， 濮春娟 ， 刘 莎 ， 罗钰枝 ， 陈美兰

(中国中医科学院中药资源中心 ， 北京 东城 100007)

随着畜禽饲料禁抗令的全面推进，寻找更为安全高效的抑菌杀菌药物迫在眉睫。天然中草药因具有抗菌范围广、毒性低、不易产生耐药性以及价格低廉等优点成为动物替抗药研究的焦点。大量的文献表明，清热解毒类中药在细菌感染治疗中表现出很好的疗效，如清热药黄芩、黄连、黄柏能有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和嗜酸乳杆菌的增殖[1]。中药(Traditional Chinease medicine,TCM)的许多有效成分都具有抗菌活性，黄酮类如黄芩苷，生物碱类如黄连小檗碱，有机酸类如绿原酸，以及挥发油成分等都具有显著的抑菌杀菌作用[2]。现代中药企业生产中产生了大量的中药废弃物——中药渣、中药材非药用部位等，清热类中药废弃物大都保留多种抗菌抑菌活性成分，也极具开发利用价值。例如，杨璇璇等[3]优化提取工艺,从1 g苦参渣中提取到5.632 mg苦参碱；李静等[4]研究发现，忍冬根、藤、叶和果都含有抗菌活性成分——绿原酸。基于此，本试验以7种中药废弃物和3种中药复方为材料，研究它们对大肠埃希菌、肠炎沙门菌和金黄色葡菌球菌的体外抑制作用，为畜禽细菌感染的防治以及中药废弃物的综合利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料 中药复方1(金银花、连翘、黄芩等)、中药复方2(地锦草、石膏、栀子等)、中药复方3(黄连、石膏、苦参等)、牛黄上清药渣(黄连、黄柏、黄芩等17种药渣)、连花清瘟药渣(连翘、金银花、炙麻黄等13种药渣)、银翘药渣(金银花、连翘、薄荷等9种药渣)、清开灵药渣(栀子、板蓝根、金银花)、苦参药渣、忍冬藤、忍冬叶，中药复方和中药废弃物均来自河北森隆药业。中药渣来自以岭药业和白云山明兴制药有限公司。氨苄西林粉末(>98%)，购自北京华越洋生物公司，批号：BC2008K。头孢噻肟钠粉末(>98%),购自生工生物工程(上海)股份有限公司,批号：FA29BA0009。氨苄西林药敏纸片和头孢噻肟钠药敏纸片，均购自上海源叶生物科技有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂糖，均购自英国OXOID生物公司。NaCl，购自天津鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 供试菌种 大肠埃希菌(CVCC3959)、肠炎沙门菌(CVCC3949)、金黄色葡萄球菌(CVCC4098)冻干粉，均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.3 方法

1.3.1 药液制备 中药复方/中药废弃物粉碎成粗粉。分别取40 g药粉，1∶10(m/V)加入400 mL 70%乙醇-水溶液浸泡过夜，超声提取2次，合并滤液。旋蒸滤液浓缩至1 g/mL。浓缩液过0.22 μm滤膜除菌，放置4 ℃冰箱保存，备用。

1.3.2 菌液制备 吸取少量培养基溶解菌冻干粉，吸取40 μL菌液到培养基中，200 r/min,37 ℃培养24 h复活菌种。吸取菌液平板划线分离单菌落。挑取单菌落到液体培养基，200 r/min，37 ℃培养6 h。在对数期将菌液稀释到106CFU/mL，备用。

1.3.3 抑菌圈检测 参照文献[4]将直径6 mm空白药敏纸片浸泡在1 g/mL中药提取液中，待浸透后取出，超净台内风干备用。吸取少量菌液均匀涂布平板，待菌液稍吸收后取含药纸片贴在平板上。每个平板均匀贴2张含药纸片及1张对照药物药敏纸片(氨苄西林或头孢噻肟钠)。纸片间圆心距要大于3 cm。每组设置3个平行。37 ℃静置培养24 h后分别测量抑菌圈直径，并计算平均值和标准差。

抑菌强度判断标准：抑菌圈直径≥20 mm为极敏，抑菌圈直径在15～19 mm为高敏，抑菌圈直径在10～14 mm为中敏，抑菌圈直径<10 mm为低敏，无抑菌圈为耐药。

1.3.4 最低抑菌浓度(MIC)检测 参照文献[5]通过二倍稀释法测中药最低抑菌浓度。取96孔微量板，在第1～11孔加入100 μL培养基，第1孔加入 100 μL药液，混匀后吸取100 μL到第2孔，重复操作，第8孔弃100 μL。最终1～8孔浓度分别为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.81 mg/mL和3.91 mg/mL。第9孔为阴性对照，加100 μL培养基。第10孔为药物对照，加入氨苄西林(金黄色葡萄球菌的药物对照)或头孢噻肟钠。每个药物设置3个平行。每孔加入10 μL菌液，置于37 ℃培养24 h后观察结果。培养基肉眼可见澄清即认为该浓度对相应菌种有抑菌作用。

药物抑菌强度判定标准：当MIC<7.81 mg/mL为高度敏感；当7.81 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL为中度敏感；MIC>250 mg/mL为不敏感。

1.3.5 最低杀菌浓度(MBC)检测 挑选出对应中药抑菌MIC以及比MIC高1倍浓度的培养基进行平板涂布，每组浓度设置3个平行。置于37 ℃培养24 h后观察结果。平板内菌落数≤5可认为该浓度能有效杀菌。

2 结果

2.1 3种中药复方和7种中药废弃物对3种病原菌的抑菌圈检测 不同种类的中药废弃物以及中药复方对金黄色葡萄球图和其他2种病原菌的抑菌作用有明显差异。对于金黄色葡萄球菌，3种中药废弃物和3种中药复方都具有明显的抑菌作用，但是抑菌作用强度不同，结果见表1。其中中药复方1、中药复方3、银翘药渣对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均>20 mm，为金黄色葡萄球菌极敏药物。中药复方2、牛黄上清药渣的抑菌圈直径分别为17.11 mm和18.17 mm，介于15～19 mm，为金黄色葡萄球菌高敏药物。连花清瘟的抑菌圈直径为13.58 mm，介于10～14 mm，表现为金黄色葡萄球菌中敏药物。而忍冬藤、忍冬叶、苦参渣、清开灵渣对金黄色葡萄球菌没有明显抑菌圈。另外，对照药物氨苄西林对金黄色葡萄球菌抑菌圈的平均直径为41.06 mm，为金黄色葡萄球菌极敏药物。而对于大肠埃希菌，只有中药复方1对大肠埃希菌有明显抑菌透明圈，平均抑菌圈直径为13.89 mm，这表示大肠埃希菌对该药中度敏感。然而，10种药物对于肠炎沙门菌都没有抑菌透明圈。

表1 金黄色葡萄球菌抑菌圈检测

另外，对照药氨苄西林对于大肠埃希菌和肠炎沙门菌也没有明显的抑菌透明圈，而另一种对照药头孢噻肟钠对上述2种病原菌具有明显的抑菌圈，抑菌圈大小分别为25.18 mm和38.60 mm，为极敏药物。该结果表明大肠埃希菌和肠炎沙门菌对于氨苄西林具有耐药性，而对头孢噻肟钠极敏。因此在进行大肠埃希菌和肠炎沙门菌的MIC和MBC试验时采用头孢噻肟钠作为对照药物。

2.2 3种中药复方和7种中药废弃物对3种病原菌的MIC 结果表明不同种类中药复方以及中药废弃物对于金黄色葡萄球菌和其他2种病原菌的最低抑菌浓度有差异(表2)。对于金黄色葡萄球菌，3种中药复方和6种中药废弃物(除清开灵药渣外)都能有效抑制金黄色葡萄球菌生长，但是MIC不同。其中牛黄上清、银翘、连花清瘟药渣和中药复方1的MIC值为3.91 mg/mL，说明金黄色葡萄球菌对这4种药物高度敏感。其余6种药物对金黄色葡萄球菌MIC值均在7.81～250 mg/mL，属于中度敏感药物，抑菌强度(MIC值大小)：中药复方2>中药复方3>忍冬藤>忍冬叶=苦参>清开灵药渣。

表2 3种中药复方和7种中药废弃物对3种病原细菌最低抑菌浓度Table 2 Minimum inhibitory concentration of 3 TCM compounds and 7 TCM residues to 3 pathogenic bacteria (mg/mL)

对于大肠埃希菌，3种中药复方和4种中药废弃物有中度抑制该菌生长的作用。抑菌有效的7种药物对大肠埃希菌MIC值在62.5～250 mg/mL，为中度敏感药物，抑菌强度(MIC值大小)：中药复方1>中药复方3>中药复方2=牛黄上清药渣=银翘药渣=清开灵药渣=忍冬藤。连花清瘟药渣、忍冬叶和苦参渣MIC值均≥500 mg/mL,抑菌无效。

针对肠炎沙门菌，4种中药废弃物以及中药复方1对该菌有中度抑菌作用。中药复方1和忍冬藤等4种中药废弃物对肠炎沙门菌的MIC值在125～250 mg/mL，为肠炎沙门菌中度敏感药物，抑菌强度(MIC值大小)：中药复方1=忍冬藤>牛黄上清药渣=银翘药渣=清开灵药渣。中药复方2、中药复方3、连花清瘟药渣、忍冬叶和苦参渣MIC值均≥500 mg/mL，抑菌无效。

2.3 3种中药复方和7种中药废弃物对3种病原菌的MBC 3种中药复方和7种中药废弃物对金黄色葡萄球菌有显著杀菌作用，但对大肠埃希菌和肠炎沙门菌杀菌作用不佳，结果见表3。试验中10种药物对金黄色葡萄球菌都有不同程度的杀菌效果。中药复方1、牛黄上清药渣、银翘药渣、中药复方2和连花清瘟药渣对金黄色葡萄球菌的MBC值在3.91～7.81 mg/mL，为金黄色葡萄球菌强效杀菌药物。10种药物的杀菌强度(MBC值)：中药复方1=银翘药渣>中药复方2=连花清瘟药渣>牛黄上清药渣>苦参渣>忍冬叶>清开灵药渣。

表3 3种中药复方和7种中药废弃物对3种细菌最低杀菌浓度Table 3 Minimum bactericidal concentration of 3 TCM compounds and 7 TCM residues to 3 pathogenic bacteria (mg/mL)

10种药物对大肠埃希菌和肠炎沙门菌的杀菌作用较弱。对于大肠埃希菌，中药复方1和5种中药废弃物(牛黄上清药渣、银翘药渣、忍冬叶、忍冬藤和清开灵药渣)MBC值均为500 mg/mL。然而，连花清瘟药渣、中药复方2、中药复方3和苦参渣的MBC值在500 mg/mL以下，没有杀大肠埃希菌作用。对于肠炎沙门菌，中药复方1杀菌效果最好，MBC值为250 mg/mL。而牛黄上清药渣、银翘药渣、中药复方2和清开灵药渣的MBC值均为500 mg/mL,说明这4种药物在高浓度下也能有效杀菌。而连花清瘟药渣、中药复方3、忍冬叶、忍冬藤、苦参渣的MBC值为500 mg/mL，也没有表现出杀肠炎沙门菌作用。

3 讨论

大肠埃希菌、肠炎沙门菌和金黄色葡萄球菌发病率高、致病性强，对畜禽动物的生命健康有很大的威胁，同时直接影响到食品安全。相比于抗生素，清热类中药治疗细菌感染更为安全有效。本试验结果表明，9种药物(除清开灵药渣外)都对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌和杀菌作用，其中中药复方1、中药复方2、牛黄上清药渣、连花清瘟药渣和银翘药渣对金黄色葡萄球菌为高度敏感药物。因此中药复方1、中药复方2、牛黄上清药渣、连花清瘟药渣和银翘药渣都可进一步研究开发成用于防治由金黄色葡萄球菌引起的家禽、家畜疾病的药物。然而，仅有中药复方1和中药复方3对大肠埃希菌表现为中度敏感；仅有忍冬藤和中药复方1表现为肠炎沙门菌中度敏感。因此为了筛选出对大肠埃希菌和肠炎沙门菌表现为高敏感的中药复方或中药废弃物，我们将选择更多的中药复方和中药废弃物来进行抑菌试验。

大部分清热类中药本身具有广谱抑菌作用。由于提取工艺和成本限制，药渣会残留部分药效成分，再次提取依然能发挥出不同程度的抑菌作用。史利克等[7]试验发现，连花清瘟浸膏在低浓度(2～8 mg/mL)对耐药金黄色葡萄球菌有抑菌作用，在128 mg/mL下抑制大肠埃希菌生长。本试验结果与史利克等[7]的结果相符，连花清瘟药渣在低浓度(7.81 mg/mL)下可以对金黄色葡萄球菌有抑制作用，在高浓度(500 mg/mL)下对肠炎沙门菌和大肠埃希菌也有抑菌作用。可能是因为连花清瘟本身含有多种抗炎抑菌作用成分，如薄荷脑、绿原酸、连翘苷和大黄黄酮类等[8]，提取后的连花清瘟药渣也保留了部分的抑菌成分。而另一种清热燥湿中药——苦参，也含有多种抑菌活性成分，苦参总生物碱、苦参黄酮等对多种致病菌有一定的抑制作用[9]，本试验结果也表明苦参渣对金黄色葡萄球菌具有中度抑菌作用。

忍冬药用部位忍冬花通常被认为是药效成分积累最多的植物部位，但同一药用植物上非药用部位也有含量稍低的相同药效成分，也能在一定程度上发挥出药效[10]。金银花、忍冬叶、忍冬藤都含有抑菌成分如绿原酸和黄酮类，但抑菌活性成分在忍冬不同部位的浓度不同[11]。李瑞国等[12]研究发现,忍冬藤提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性强于忍冬叶，而对大肠埃希菌的抑菌活性不及忍冬叶。本试验同样发现，忍冬叶和忍冬藤都有抑制金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的作用。但忍冬藤对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑制作用都强于忍冬叶。本试验结果优于前人的结果，可能是因为试验采用的提取方法不同导致提取效率有差异，本次采用的提取方法可能对忍冬藤有效成分的提取效率更优。

大部分中药非药用部位和中药渣目前主要是当作生活垃圾进行焚烧、填埋和固定区域堆放处理。这不仅要投入大量的资金，占用了大量的土地资源，还污染了土地及地下水，也造成中药废弃物资源的浪费[13]。本试验结果表明，7种清热类中药非药用部位和中药药渣仍保留部分药效成分，依然可以发挥出药效价值，具有开发成动物替抗药物的潜力。本试验可为将来利用中药废弃物开发中药抗生素提供思路和指导。另外，为了进一步将此类药物开发成动物替抗药物，还需要深入考察其在染病畜禽体内的作用机制及安全性。