牛源产志贺毒素大肠杆菌血清型及耐药性分析

马萍萍 ， 刘宝涛 ， 赵永达 ， 刘焕奇 ， 邹 明

(青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109)

大肠杆菌分为不致病的正常共生菌群和可引起人和动物不同症状的致病性大肠杆菌。产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC)是一类携带了1种或2种志贺毒素基因(stx)的新发高致病性食源性致病菌[1]，可引起腹泻、出血性肠炎及溶血性尿毒综合征(HUS)等，给公共卫生和人类健康带来威胁。牛、羊等反刍动物是STEC的主要储存宿主[2]。

致病性主要通过相关毒力因子来表达，在与STEC相关的毒力因子中，最主要的是由stx基因编码的志贺毒素。其次还有紧密素、菌毛、外膜蛋白和脂多糖等毒力因子[3]。血清型为O157∶H7的菌株是20年来大多数食源性疾病暴发的主要原因[4]，现有超过200种非O157血清型的STEC能引起人类疾病，其中O26、O45、O103、O111、O121和O145称为“前6名的非O157型STEC血清型”[5]。

目前，致病菌的耐药对人与动物健康构成重大威胁，耐药菌可通过食物链在人与食物、人与人或人与畜之间传递[6]。根据我国现有报道，国内对牛源STEC的研究大部分都是从牛粪便或牛肉中分离到的，对牛奶中STEC的研究少有报道。因此，本试验的目的是从奶牛粪便、牛奶以及牛场环境中分离鉴定STEC菌株，调查其流行情况、血清分型并分析其耐药性，为指导合理用药和保障公共卫生安全提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品 本实验室保存的780株牛源大肠杆菌，包括牛奶源203株，粪便源475株，饮水源19株，污水源51株，土壤源32株。

1.2 试剂与药品 LB肉汤、麦康凯琼脂、MH肉汤和MH琼脂，均购自青岛海博生物技术有限公司；Taq酶、Marker 2 000，均购自TaKaRa公司。药敏试验药物(氨苄西林、头孢噻呋、萘啶酸、恩诺沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、四环素、链霉素、磷霉素、卡那霉素、氟苯尼考、阿米卡星、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑)，均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR检测stx基因 煮沸法提取细菌的DNA，参考文献[7]合成引物,引物序列见表1。通过PCR方法检测stx1和stx2基因，扩增后测序。PCR反应采用25 μL体系：ddH2O 18.375 μL，PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.125 μL，DNA 1 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；延伸72 ℃ 5 min。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.2 血清分型 O血清型的鉴定采用PCR方法检测共30种不同特异性O抗原编码基因[8]，包括O1、O2、O4、O6、O7、O8、O9、O15、O18、O21、O22、O25、O26、O45、O55、O78、O83、O86、O101、O103、O111、O113、O117、O121、O138、O145、O149、O157、O158和O165。

1.3.3 药敏试验 根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)抗菌药物敏感性试验执行标准M100-S22，采用琼脂稀释法测定27株STEC菌株对13种抗菌药的最小抑菌浓度(MIC)。13种抗菌药物包括氨苄西林(AMP)、头孢噻呋(CTF)、萘啶酸(NAL)、恩诺沙星(ENR)、左氧氟沙星(LEV)、环丙沙星(CIP)、四环素(TET)、链霉素(STR)、磷霉素(FOS)、卡那霉素(KAN)、氟苯尼考(FFC)、阿米卡星(AMK)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(SXT)，大肠杆菌标准菌ATCC25922作为质控菌株。分析得到的MIC值，判断药物的敏感性。

2 结果

2.1 STEC鉴定 经测序比对，从22个牛场分离到的780株大肠杆菌中共鉴定出27株STEC，总检出率为3.46%(27/780)。27株STEC菌株分别来自10个牛场，值得注意的是，场10中在牛奶和污水中同时检出STEC，结果见表2。其中来源奶牛粪便、牛奶、饮水和污水的STEC菌株分别为17、7、2株和1株，检出率分别为3.58%(17/475)、3.45%(7/203)、10.53%(2/19)和1.96%(1/51)。27株STEC中有9株仅携带stx1基因，6株仅携带stx2基因,同时携带stx1基因和stx2基因的有12株。

表2 牛源STEC的检出率Table 2 Detection rates of STEC in cattle (%)

2.2 血清分型 对27株STEC通过PCR方法检测了比较常见的或流行较高的30种O血清型，在鉴定出的14株STEC菌株中，分为9种不同的O血清型，鉴定结果表明，O78血清型菌株最多，有4株，占定型菌株的14.8%，为优势血清型，结果见表3。

表3 血清型鉴定结果Table 3 Detection results of O serotyping

2.3 药敏试验 对27株STEC进行抗生素敏感性试验，结果见表4。其中对四环素、氨苄西林有较强的耐药性，耐药率分别为88.9%和81.5%；对甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、头孢噻呋和萘啶酸的耐药率较高，分别为59.3%、37.0%和22.2%；其次是磷霉素和链霉素，均为18.5%；对恩诺沙星和氟苯尼考的耐药率较低，均为11.1%；对阿米卡星、环丙沙星和左氧氟沙星全部敏感。

表4 药敏试验结果Table 4 Drug sensitivity test results

3 讨论

3.1 牛源STEC的检出率分析 本试验通过对青岛地区奶牛场分离到的780株大肠杆菌进行鉴定，共鉴定出27株STEC，总检出率为3.46%(27/780)，其中牛粪便中的检出率为3.58%(17/475)，低于文献[9]报道的牛粪便中STEC的检出率19.4%,与国内其他地区相比有一定相似性，略高于邵纯纯[10]对山东济宁和烟台两地区动物粪便中STEC的检出率2.54%(26/1 022)；牛奶中STEC检出率为3.45%(7/203)，低于文献[11]报道的牛场牛奶中的检出率6.59%(52/789)。本试验发现，场10中在牛奶和污水中同时检出STEC，这可能与奶牛场的饲养管理、养殖环境有关，分布于水中的STEC可能成为传染源，因此应该注意养殖场的环境卫生。

3.2 STEC血清型分析 大肠杆菌在不同地区有不同优势血清型，本试验通过PCR方法检测了30种常见的STEC血清型，共鉴定出14株非O157型STEC，还有一些菌株未鉴定出血清型，血清型分布比较分散，其中O78型(4/14)最多。与Johnson等[12]报道的流行血清型O26、O45、O111、O103、O145和O121等具有一定的差异性。与薛涛等[13]报道的江苏某奶牛场粪便中STEC的优势血清型为O4、O26和O93具有差异性。本试验中血清型的分散性与胡彬等[14]对山东地区动物源粪便中非O157型STEC血清型的报道具有相似性，血清型的分散性反映了STEC菌株的复杂性和多态性，因此，应加强对非O157血清型的监测。

3.3 STEC的药物敏感性分析 本试验结果发现，27株STEC对四环素的耐药率最高(88.9%)，其次为氨苄西林(81.5%)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(59.3%)和头孢噻呋(37.0%)，对阿米卡星、环丙沙星和左氧氟沙星全部敏感。与国内报道具有一定相似性，武瑞兵等[15](2015年)对牛肉源大肠杆菌耐药性的研究显示，四环素(89%)和氨苄西林(42%)的耐药率最高；李明成[16](2005年)的研究中牛源STEC菌株对氨苄西林(88%)和四环素(88%)耐药率最高。与白莉等[17](2014年)从食品中分离到STEC对氨苄西林的(57.8%)和四环素(73.3%)耐药率差异较大，与磺胺甲噁唑的耐药率(62.0%)接近，与阿米卡星的敏感率(97.8%)相似。本试验中，STEC对四环素、氨苄西林、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、头孢噻呋的耐药率较高，可能与四环素类药物和磺胺类药物被用作促生长剂在临床使用多年，头孢噻呋是动物专用药物有关。第3代喹诺酮药物耐药率中恩诺沙星(11.1%)高于环丙沙星(0)和左氧氟沙星(0)，这与恩诺沙星是专用于兽医临床的第3代喹诺酮类药物有关。同时本试验菌株存在多药耐药现象，以2耐和3耐为主。因此，应及时监测并掌握STEC菌株的耐药特点，为牛场合理用药提供理论指导，根据耐药谱有针对性地使用抗菌药物，以减缓耐药菌株的出现。