番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析

戴 银 ， 胡晓苗 ， 赵瑞宏 ， 张丹俊 ， 潘孝成 ， 沈学怀 ， 尹 磊 ， 周学利 ， 侯宏艳

(安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 安徽 合肥 230031)

番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起，严重危害番鸭养殖业的急性传染病[1]。该病主要临床症状为腹泻、呼吸困难、拒食、脚软等，传播方式较多，尤其是雏番鸭易感染发病，死亡率可高达80%[2-3]，对我国很多地方番鸭的健康养殖已经造成严重影响[4-8]。MDPV为细小病毒科、依赖病毒属成员，线性、单链DNA病毒，基因组大小约5kb。基因组包括2个开放阅读框(Open read frame,ORF)，左侧ORF编码非结构蛋白NS，右侧ORF编码结构蛋白 VP。NS蛋白参与病毒DNA复制及基因表达，对宿主细胞产生毒性作用等；VP蛋白编码的病毒粒子衣壳蛋白，诱导机体产生中和抗体，与病毒致病力密切相关[9-12]。2种蛋白作为病毒的重要结构成分，均具有不可替代的生物学功能。2019年本课题组对安徽省2个不同地方的MDPV毒株进行了分离鉴定，本试验通过分段扩增获得了2株番鸭细小病毒基因组NS和VP全长基因序列并进行了分析，为下一步研究水禽细小病毒宿主差异、分子致病机理和遗传变化规律提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株基因组DNA 番鸭细小病毒安徽分离株AH1901和AH1902基因组DNA由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所实验室分离、鉴定并保存。毒株AH1901和AH1902分离于2019年，分别来自安徽合肥和安庆地区。

1.1.2 主要工具酶和试剂 DNA Marker DL2 000等，均购自宝生物工程(大连)有限公司；Taq酶、dNTP、琼脂糖(电泳纯)等，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照GenBank数据库中MDPV毒株SAAS-SHNH的基因组序列(登录号：KC171936)，用Primer Premier 5.0软件设计5对特异性扩增引物。P1：5′-GACATGGCACTTTCTAGG-3′，P2：5′-TAGTTCTTTGCTGCTCTGTT-3′；P3：5′-TCAACTGTAGCTCCCCTTAT-3′，P4：5′-AGACATAGCTATTTTGAATC-3′；P5：5′-GCTCTTTGCTTCAGTTGCTC-3′，P6：5′-CAGGTTCGGAGCCTTCGGTG-3′；P7：5′-ACCTGTGGCAGCACCTAA-3′，P8：5′- CGCCTTTCACAGCCTTTT-3′；P9：5′-AAAAGGCTGTGAAAGGCG-3′，P10：5′-GAACGAACCCTCCAATGA-3′。预期目的扩增片段大小分别为680、1 270、890、809 bp和920 bp，序列拼接后基因片段全长4 190 bp，包括完整的NS基因和VP基因编码区。

1.2.2 基因组的分段扩增 以基因组DNA为模板，分别采用P1 和P2、P3 和P4、P5 和P6、P7 和P8、P9 和P10为上下游引物扩增。PCR反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL,上下游引物各1.0 μL，DNA 2 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，加双蒸水补足50 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，45 ℃/51 ℃/51 ℃/53 ℃/53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化、测序。

1.2.3 基因序列分析 应用DNASTAR软件拼接基因序列，DNASTAR中的Megalign程序进行同源性分析。采用Clustal X 1.83软件分析比对基因序列，MEGA 5.0软件Neighbor-joining方法构建遗传进化树，聚类分析的可靠性用Bootstrap置信区限检测，同时每1 000 Bootstrap测试结果大于50%的在节点上显示。基因片段拼接后获得NS基因和VP基因全长核苷酸序列，与GenBank中登录的MDPV、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)毒株相应序列进行对比分析。参考毒株基因组GenBank登录号及信息见表1。

表1 参考毒株信息Table 1 Details of reference virus strains

2 结果

2.1 基因的扩增 以提取的分离株AH1901和AH1902基因组DNA为模板，P1和 P2、P3和P4、P5和 P6、P7和P8、P9和P10为PCR引物，分别扩增获得了约680、1 270、890、809 bp和920 bp的特异性DNA片段(图1)，并将扩增的基因产物测序。获得的序列与GenBank中登录的MDPV全长基因进行比对，显示均为目的基因序列。

图1 基因组的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of viral genomeM：DNA标准分子量; 1～5：分别以P1和 P2、P5和 P6、P3和P4、P7和P8、P9和P10为引物的PCR产物M:DNA Marker; 1-5:PCR products of P1 and P2,P5 and P6,P3 and P4,P7 and P8,P9 and P10 primers,respectively

2.2 基因序列特征 序列分析可见，扩增获得的2个MDPV基因组片段均包括完整的NS基因和VP基因，其中NS基因全长1 884 bp，NS1和NS2长度分别为1 884 bp和1 356 bp，二者共用同一终止密码子；VP基因全长2 199 bp，VP1、VP2和VP3长度分别为2 199、1 764 bp和1 605 bp，同样三者共用同一终止密码子。将所有获得的2个MDPV毒株及20个参考毒株基因核苷酸序列经Clustal X 1.83软件分析后可知，NS基因核苷酸替代较少，较为保守；而VP基因序列核苷酸替代较多，变异较为明显。

2.3 遗传进化分析 采用MEGA分析软件，将22条水禽细小病毒基因组序列构建系统发育树(图2)。结果显示，所比对的序列明显分为GPV和MDPV两个类群。安徽分离毒株AH1901和AH1902基因遗传距离较近，处于同一分支。二者与MDPV国内分离株ZJ-JH-2013基因遗传距离较近。与安徽分离株AH1401、AH-AQ-2015及上海分离株SAAS-SHNH遗传距离相对较远，尤其与P1疫苗株、匈牙利毒株FM、国内毒株FZ91-30等5个MDPV分离株亲缘关系较远，位于不同分支。

图2 基因组序列系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of genome sequences▲：本试验分离的病毒株▲：The virus isolates of this experiment

2.4 基因同源性分析 将MDPV和GPV的NS基因核苷酸序列进行同源性比较(图3)，结果表明，所比对的基因组序列同源性介于80.9%～99.9%，其中MDPV毒株之间同源性在98.0%以上。安徽分离株AH1901与AH1902基因序列同源性为99.8%，与GPV同源性相对较低，同源性均介于81.0%～83.2%。二者与MDPV毒株ZJ-JH-2013基因序列同源性最高，均为99.8%，与上海分离毒株SAAS-SHNH同源性均为99.6%，与安徽分离株AH1401同源性均为99.5%，与毒株AH-AQ-2015分别为99.7%和99.6%。与疫苗株P1、匈牙利分离株FM序列同源性相对较低，均为98.7%。

图3 NS基因核苷酸序列同源性Fig.3 Homology of NS nucleotide sequences

将VP基因序列进行同源性比较(图4)，结果表明VP基因核苷酸序列同源性介于79.6%～100.0%，其中MDPV之间同源性在88.9%以上。安徽分离株AH1901和AH1902基因序列一致，与GPV基因同源性均较低，与鹅源GPV毒株SYG61v仅为87.9%。与分离株ZJ-JH-2013、AH-AQ-2015同源性较高，达99.8%。与MDPV上海分离株SAAS-SHNH、安徽株AH1401基因序列同源性为99.7%，与疫苗株P1及国外分离株FM基因序列同源性仅为88.9%和89.3%。

图4 VP基因核苷酸序列同源性Fig.4 Homology of VP nucleotide sequences

3 讨论

本试验通过分段PCR扩增获得了2个MDPV安徽分离株AH1901和AH1902的NS和VP全长基因，并与GenBank数据库登录的20个MDPV、GPV基因组序列进行了比对。序列分析可知，克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因，分别为1 884 bp和 2 199 bp；VP是主要的免疫保护性抗原基因，初步分析可见相对MDPV的NS基因，VP基因核苷酸序列变异程度较高，这与已有相关研究基本一致[13-14]。进化分析显示，分离株AH1901和AH1902遗传距离较近，二者与2013年国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因序列亲缘关系最近，与重组型毒株SAAS-SHNH、2014年分离的安徽毒株AH1401，尤其与疫苗株P1及匈牙利毒株FM基因序列距离相对较远。核苷酸序列同源性分析可见，国内分离的MDPV基因同源性均较高，安徽分离株AH1901与AH1902的NS基因序列同源性为99.8%，与VP基因序列一致。与遗传进化分析结果相似，安徽分离株AH1901和AH1902与疫苗株P1及国外分离株FM的同源性均较低。此外，虽然进化树显示二者与毒株AH1401、SAAS-SHNH、AH-AQ-2015位于不同分支，但与分离株ZJ-JH-2013一样，NS基因和VP基因核苷酸序列同源性均较高。结果显示，近年国内的MDPV分离株总体遗传变异程度较小，基因组特性相对稳定[14]，但个别毒株之间仍存在一定差异，可能导致病毒株感染力的不同。

研究发现相对GPV，MDPV的宿主范围较窄，仅感染番鸭，但经常存在混合感染，甚至发生基因重组现象[15-17]。与经典型MDPV相比，重组型MDPV对雏番鸭的致死率更高，且多见肠道栓塞,已在我国流行多年[18-20]。毒株AH1401与SAAS-SHNH被认为是MDPV与GPV重组型的水禽细小病毒株[21-23]，但AH1901和AH1902与重组型MDPV毒株有一定差异，不属于同一分支亚群。二者均是2019年在安徽省2个不同地方分离获得的MDPV毒株，与分离株ZJ-JH-2013可能来源于同一经典毒株。近年重组型MDPV备受关注，但经典型毒株造成的危害也不能忽视。安徽省番鸭群细小病毒病频发，一方面与传统病毒株的变异，不科学的饲养管理相关，也可能与安徽流行株与使用较为广泛的疫苗株同源性相对较低，疫苗难以有效防控有一定关系。