B型副鸡禽杆菌田间分离株的毒力及免疫原性研究

王秀丽 ， 于 永 ， 于 雷 ， 李旭妮 ， 蒋玉文 ， 辛凌翔 ， 张 媛 ， 李俊平

(1.中国兽医药品监察所 ， 北京 海淀 100081 ； 2.南京农业大学 ， 江苏 南京 210095 ; 3.北京中海生物科技有限公司 ， 北京 海淀 100081)

鸡传染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是由副鸡禽杆菌(Avibacteriunparagallinarun,Apg)感染引起的一种急性呼吸道疾病。该病是集约化养鸡业重要的细菌病之一，主要是引起育成鸡生长不良和产蛋鸡产蛋率下降[1]，从而给养鸡业带来巨大的经济损失。2018年8月—2019年9月期间，某大型白羽肉鸡养殖场持续出现幼龄白羽肉鸡感染副鸡禽杆菌,发生传染性鼻炎。本试验从白羽肉鸡场发病鸡群病鸡中分离并鉴定出B型副鸡禽杆菌，对其毒力和免疫原性进行了测定，并将本菌对免疫了市场上销售的鸡传染性鼻炎A型、B型、C型三价灭活疫苗和A型、C型二价灭活疫苗的鸡群进行攻毒试验，以期为鸡传染性鼻炎疫苗的生产和效力评价提供重要的物质基础。

1 材料与方法

1.1 菌种 副鸡禽杆菌，分离自安徽省某白羽肉鸡养殖场，经血清型检定为B型，命名为AH-1株。

1.2 培养基及试剂 TSA、TSB培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；鸡血清、NAD，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；Tween-80、M52白油、司本，均购自北京益利药品有限公司；鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗，英特威国际有限公司生产；鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗，印度尼西亚美迪安有限公司生产；鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗，北京信得威特科技有限公司生产；鸡传染性鼻炎二价灭活疫苗(A型221株+C型H-18株)，天津瑞普生物技术股份有限公司。

1.3 实验动物及鸡胚 5～6胚龄SPF鸡胚，35～40日龄SPF鸡、65～70日龄SPF鸡，均购自北京梅里亚维通实验动物养殖公司。

1.4 毒力测定

1.4.1 攻毒菌液的培养及计数 将分离菌的冻存菌种划线接种含10%鸡血清和0.01%NAD的TSA琼脂平板，倒置于5% CO2培养箱中37 ℃培养24 h，挑取单菌落接种100 mL含10%鸡血清和0.01% NAD的TSB培养基中，37 ℃静置培养16 h。同时，再挑取单菌落接种等体积的含10%鸡血清和0.01% NAD的TSB培养基，同等条件静置培养，参照前1天计数结果，稀释菌液，测定毒力。

1.4.2 鸡胚毒力测定 将新鲜培养的菌液用TSB培养基分别稀释至5×102、1.5×103、3.0×103CFU/mL和4.5×103CFU/mL，每个浓度菌液经卵黄囊接种5～6胚龄SPF鸡胚4只，同时取4只同等条件鸡胚接种PBS作为对照，每只鸡胚接种量均为0.2 mL，于孵化箱中继续孵育，观察鸡胚的死亡情况。攻毒后对攻毒菌液进行活菌计数，确定实际攻毒剂量。

1.4.3 SPF鸡毒力测定 将新鲜培养的菌液用TSB培养基分别稀释至2.5×104、5.0×104、1.0×105CFU/mL和2.0×105CFU/mL，每个浓度菌液眶下窦接种35～40日龄SPF鸡4只，同时取4只同等条件鸡接种PBS作为对照，每只鸡接种量均为0.2 mL，观察7 d内鸡发病情况。对攻毒菌液进行活菌计数，确定实际测毒剂量。

1.5 免疫原性测定

1.5.1 免疫原的制备 参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》二○○○版[2]“鸡传染性鼻炎灭活疫苗”的制备方法制备免疫原，并参照其质量标准进行性状、无菌检验和安全检验。

1.5.2 免疫原性测定 免疫程序：用35～40日龄SPF鸡60只，AH-1抗原组免疫10只，A、B、C、D四个厂家疫苗各免疫10只，颈部皮下注射疫苗0.5 mL/只，另取10只分别颈部皮下注射0.5 mL PBS作为对照。最小发病剂量测定：按照1.4.2的方法测定分离菌对65～70日龄SPF鸡的最小发病剂量。攻毒：免疫组和对照组在免疫28 d后，每只鸡眶下窦内注射分离菌培养物0.2 mL(至少含1个最小发病剂量)，观察7 d，记录发病情况。

2 结果

2.1 攻毒菌液的培养 单菌落接种100 mL含10%鸡血清和0.01% NAD的TSB培养基，静置培养16 h活菌计数结果为1.0×109CFU/mL，估算同等条件培养的攻毒菌液活菌数为1.0×109CFU/mL。

2.2 毒力测定

2.2.1 鸡胚毒力测定 将浓度为1.0×109CFU/mL的菌液先用TSB培养基稀释105倍至浓度为1.0×104CFU/mL，后按表1稀释至测毒剂量，测毒力。攻毒菌液活菌计数复数结果为1.1×109CFU/mL，实际测毒菌液浓度分别为5.5×102、1.6×103、3.3×103CFU/mL和5.0×103CFU/mL，鸡胚攻击110 CFU以上的菌液，30 h内均可死亡，最小致死剂量为110 CFU，死亡记录见表2。

表1 攻毒菌液稀释及测毒方法Table 1 Methods of dilution and toxicity testing of challenge bacterial solution for chicken embryos

表2 AH-1株对5～6胚龄鸡胚毒力测定结果Table 2 Virulence test results of AH-1 stain in 5-6 days old chicken embryos

2.2.2 鸡毒力测定 将浓度为1.0×109CFU/mL的菌液用TSB培养基稀释103倍至浓度为1.0×106CFU/mL，然后按表3所示方法稀释至测毒剂量，测毒力。攻毒菌液活菌计数复数结果为1.1×109CFU/mL，实际测毒菌液浓度为2.2×105、1.1×105、5.5×104CFU/mL和2.8×104CFU/mL。35～40日龄SPF鸡攻击5 500 CFU以上菌液，均可在48 h内出现肿头、肿脸、流鼻涕等发病症状，在96 h以后症状逐渐减轻，至168 h后症状基本消失，最小发病剂量为5 500 CFU。发病记录见表4。

表3 鸡攻毒菌液稀释及测毒方法Table 3 Methods of dilution and toxicity testing of challenge bacterial solution for chicken

表4 AH-1株对35～40日龄SPF鸡毒力测定结果Table 4 Virulence test results of AH-1 stain in 35-40 days old SPF chicken

2.3 免疫原性测定

2.3.1 免疫原的检验 对制备的免疫原进行性状、无菌检验和安全检验，结果显示免疫原的剂型、稳定性和黏度均符合油乳剂灭活疫苗的规定。无菌检验显示，在37 ℃ CO2培养箱培养的硫盐(TG)和含有10%鸡血清和0.01% NAD的TSA琼脂斜面以及在25 ℃培养的TSB、TG和含有10%鸡血清和0.01% NAD的TSA琼脂斜面上均无菌生长，说明抗原未被污染，且灭活完全。安全性结果显示，免疫原1.0 mL(免疫剂量的2倍)免疫35～40日龄SPF鸡，14 d内免疫鸡未出现任何因为注射引起的不良反应。

2.3.2 攻毒剂量的测定 65～70日龄SPF鸡攻击4 200 CFU以上菌液，4/4可在48 h内出现肿头、肿脸、流鼻涕等发病症状，最小发病剂量为4 200 CFU，具体发病记录见表5。

表5 AH-1株对65～70日龄SPF鸡毒力测定结果Table 5 Virulence test results of AH-1 stain in 65-70 days old SPF chicken

35～40日龄SPF鸡免疫30 d后，免疫组和对照组分别眶下窦内注射1 000 CFU AH-1株(含至少1个最小发病剂量)，免疫AH-1株制备抗原的鸡10/10保护，免疫A商品鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗的鸡2/10保护，免疫B商品鸡传染性鼻炎A型、C型二价灭活疫苗的鸡0/10保护，免疫C商品鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗的鸡3/10保护，免疫D商品鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗2/10保护，对照鸡10/10发病，说明AH-1株免疫原性良好，能抵抗本菌的攻击，而市售的鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗均不能完全抵抗本菌的攻击，鸡传染性鼻炎A型、C型二价灭活疫苗完全无法抵抗B型菌的攻击，说明A、C型副鸡禽杆菌和本B型副鸡禽杆菌之间无交叉保护(表6)。

表6 免疫保护试验结果Table 6 Immune protection test results

3 讨论

本试验测定了从安徽省某肉鸡场分离的1株副鸡禽杆菌的毒力和免疫原性，同时还将本菌制备的抗原与目前国内外市场上销售的鸡传染性鼻炎三价或者二价灭活疫苗免疫效力进行比较。毒力试验结果显示，本菌对5～6胚龄鸡胚及35～40日龄SPF鸡均有较强的致病力，毒株对鸡胚的最小致死剂量为110 CFU，对SPF鸡的最小发病剂量为5 500 CFU，而鸡传染性鼻炎灭活疫苗的生产检验用毒株Hpg-8(A型)和Hpg-668(C型)最小致死剂量约为300 CFU，对SFP鸡的最小发病剂量均为7.5×104CFU，有40%左右的鸡发病症状不典型，以106CFU BJ-05株(B型)感染SPF鸡，仍有2/5的鸡只未发病，说明本菌株的毒力较目前国内的疫苗株毒力均强[2-3]。免疫原性试验结果显示，本菌免疫原性良好，而市场上销售的3个鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗均无法完全抵抗本菌的攻击，鸡传染性鼻炎A型、C型二价灭活疫苗完全不保护，显示分离菌和疫苗毒株之间的抗原性存在差异，本菌制备的免疫原对目前鸡传染性鼻炎三价苗的B型强度株和流行的B型野毒株是否具有保护力，有待进一步研究。

副鸡禽杆菌的致病性和保护性抗原均与多种因素有关，其中HA抗原是研究者们最关注的[4-6]，HA抗原、荚膜多糖、金属蛋白酶等均与毒力相关[7-8]，有文献报道副鸡禽杆菌中提取的HA抗原具有保护性，但疫苗免疫后不刺激产生HI抗体同样具有保护性[9]，说明其他抗体在免疫保护过程中也产生重要作用。

目前认识的9种副鸡禽杆菌的Kume血清型分别为A型(A1、A2、A3、A4)、B1型、C型(C1、C2、C3、C4)，且9个不同血清型参考菌株之间的交叉保护试验已经完成，充分证明了A型、B型、C型血清群之间的免疫关系相距较远。也有证据显示，在Page血清型B血清群内只有部分交叉保护[9]。

本试验再次证明鸡传染性鼻炎灭活疫苗只能提供含有血清型的保护，而B型菌不同菌株之间只能提供部分交叉保护。龚玉梅等对我国鸡传染性鼻炎流行态势分析显示，我国2012—2017年鸡传染

性鼻炎以B型株为主，而2019年其流行情况发生变化[10-11]。冀笑明等2019年流行病学调查结果显示，B型副鸡禽杆菌仍大面积流行且占主导地位[12]。近几年，我国免疫疫苗的祖代种鸡、蛋鸡、肉鸡养殖场鸡传染性鼻炎在全国范围内频发，推测疫苗毒株与流行毒株之间抗原性存在差异是免疫失败的重要原因。因此，研制含有多个B型分离株的疫苗或筛选免疫原性好，交叉保护效果好的毒株是预防和控制本病流行的重要方向。