基于止血作用的三七粉质量标志物研究＊

李 新，徐 旭，许 浚，郭海彪，李晓霞，林 娟，张铁军＊＊，刘 旻＊＊

（1.天津药物研究院/天津市中药质量标志物重点实验室 天津 300301；2.天津药物研究院 中药现代制剂与质量控制技术国家地方联合工程实验室 天津 300301；3.广州白云山和记黄埔中药有限公司 广州 510515；4.华北理工大学研究生院 唐山 063200）

中药材是生产中药饮片和中成药的基本原料，其质量是保证中药饮片和中成药质量的关键和基础。因此，中药材质量的规范化是保证中药材质量的重要措施和重要前提[1]。中药质量评价模式目前呈现多元化发展趋势，相关质量评价技术涵盖多个领域的先进技术，如光谱、色谱、生物评价、多组学分析等。虽然中药检测与质量评价的指标较多，但呈现碎片化的状态，与药效的关联不明确[2]。2016 年刘昌孝院士创造性地提出了中药质量标志物（quality marker，QMarker）这一核心质量概念。该概念关联安全性和有效性，着眼于中药全过程的物质基础的特有、差异、动态变化和质量的传递性、溯源性，并且具有整体、多元质控的特点[3-4]。

随着中药质量标志物研究的进展，近年来我国在中药监管方面取得了一定的成效，为了更好地筛选中药质量标志物，反映中药的整体功效，张铁军等[5]对延胡索进行了示范性研究，通过初步探索建立一条比较完整的中药质量标志物研究思路。研究发现延胡索植物成分中的生物碱主要由氨基酸途径合成，特异性较强的成分在生源途径下游的位置，再结合含量筛选出潜在的中药质量标志物。中药功效以网络药理学预测活性成分，从整体动物、器官、细胞、受体等多层面研究其信号通路，以仿生学和功能受体相结合进行物质筛选，再结合入血成分研究，最终确定7个延胡索的质量标志物。许多学者对诸多药材做了较为全面的中药质量标志物的预测研究，但饮片的质量标志物研究较少，没有系统地进行探索[6],中药饮片的不合格率仍然占有一定比例。

中药三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根茎，产地为云南、广西等地区，性温，味甘、微苦，归肝、胃经，功效为散瘀止血、消肿定痛，主要用于治疗外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等[7-8]，其主要特点为即有活血作用又有止血作用。三七的止血作用被广泛应用在临床中，主要应用于急性软组织损伤、消化道出血、术后出血、妇科出血、脑出血等领域。宋振华等对60例急性软组织损伤患者采用三七散治疗可以快速改善临床症状,急性期效果显著[9]。赵岩等采用大黄三七粉治疗消化道出血的病人，经过一个周期的治疗后实验组的有效率（96.00%）远高于对照组（76.00%）[10]。郑丹丹等观察三七重楼生化汤联合二次剖宫产术中子宫瘢痕切除对预防子宫切口憩室（PCSD）形成的作用，发现治疗后血性恶露持续时间和子宫收缩痛评分减低[11]。彭皇青等采用白及三七散治疗先兆流产中阴道出血100 例，阴道出血停止时间、腰痛缓解时间及腹痛缓解时间均短于对照组[12]。隆康健等采用三七白及散治疗丘脑出血41 例，总有效率（87.8%）明显高于对照组（62.5%）,出血持续时间短于对照组,应激性溃疡发生率、神经功能评分、血浆皮质醇、ACTH 水平较对照组显著降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）[13]。

三七药材经分离鉴定，其主要化学成分为皂苷类，化学结构复杂，同时含有黄酮、甾醇、糖、挥发油、聚炔醇、氨基酸和有机酸等类化学成分[14-15]。2020 年版《中华人民共和国药典》记载三七含量测定以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1为指标[16]。本课题组前期研究三七成分对凝血指标TT、APTT、PT、FIB，以及血小板聚集率、血管动脉条收缩功能等的影响，研究发现三七中人参皂苷F2、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rk1、槲皮素等，包括《中华人民共和国药典》记载的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1等均具有抗凝活血作用，表明《中华人民共和国药典》标准中没有明确止血成分。本研究在前期网络药理学、入血成分研究及基于活血作用质量标志物研究基础上，对三七超微粉中单体成分的止血作用进行考察，探索三七超微粉基于止血作用的质量标志物。

1 实验材料

三七素（批号：R05N10F102244）和人参皂苷Rb2（批号：P15O10F94983）购自上海源叶生物科技有限公司，用于缩血管研究。三七素以磷酸缓冲液（PBS）配制成储备液，人参皂苷Rb2以二甲基亚砜（DMSO）配制成储备液。

试剂盒：凝血酶时间（TT）（批号：031906A）、活化部分凝血酶原时间（APTT）（批号：021908A）、凝血酶原时间（PT）（批号：011710A）、纤维蛋白原（FIB）（批号：041904B）试剂盒均购自美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司。试剂：二磷酸腺苷（ADP）（批号：SLCB5611）购自Sigma 公司；去氧肾上腺素（苯肾上腺素，PE）（批 号：MTBXK-CP）购 自Tokyo chemical industry公司。

仪器：凝血因子分析仪（LG-Paker 1），北京普利生仪器有限公司；血小板聚集仪（型号：540VS），美国Chrono-log 公司；JZ301 型微张力换能器，北京新航兴业科贸有限公司；MP-150 多导生理信号记录仪、DA100C 通用放大器，Biopac 公司；HSS-1B 型离体器官恒温装置，成都仪器厂。

动物：家兔，北京隆安实验动物养殖中心，生产许可证号：SYXK（京）2019-0009。

2 实验方法

2.1 对凝血指标的影响

家兔6 只，雄性，适应性喂养一段时间后，禁食过夜，颈总动脉取血，枸橼酸钠抗凝，在3000 rpm 离心10 min 制备血浆，在兔血浆中加入三七素样品（以DMSO配制），浓度分别为0.05、0.5、5、50、100、500、1000 μM；分别设空白对照组和DMSO 对照组。采用凝血记录仪，依据试剂盒说明书操作，测定TT、APTT、PT、FIB。

2.2 对血小板聚集率的影响

家兔6 只，雄性，适应性喂养一段时间后，禁食过夜，颈总动脉取血，枸橼酸钠抗凝，在1000 rpm 离心10 min 制备富含血小板血浆；在3000 rpm 离心10 min 制备贫血小板血浆。在兔血浆中加入三七素药物样品（以双蒸水配制），浓度分别为0.05、0.5、5、50、100、500、1000、2000 μM，预孵10 min 后加入ADP，终浓度为6 μM；溶剂对照组加入等体积双蒸水。采用比浊法，测定血小板聚集率。

2.3 对血管平滑肌的影响

药物配制：人参皂苷Rb2以DMSO 配制成50 mM储备液，随后分别用DMSO 稀释为所需浓度。三七素以双蒸水配制为50 mM 储备液，随后分别用双蒸水稀释为所需浓度。

营养液（Krebs-Henseleit 液）组成：NaCl 119 mM、KCl 4.7 mM、MgCl21.2 mM、NaHCO312.0 mM、NaH2PO41.2 mM、葡萄糖11 mM和CaCl22.5 mM。

动脉条制备：家兔6 只，雄性，适应性喂养一段时间后，禁食过夜，戊巴比妥钠麻醉，颈总动脉放血后，迅速开胸取胸主动脉，置于预冷生理盐水中剥离血管表面筋膜，用小眼科剪将主动脉剪成若干螺旋条。

血管反应性检测：将动脉条置于组织灌流系统37℃恒温水浴槽中，营养液完全浸没，给予混合气体；动脉条下端固定，上端链接张力换能器，计算机采集张力变化数据。营养液中加入去氧肾上腺素，终浓度为0.5 mg·L-1，使动脉条发生收缩反应，待张力达到最大并稳定至一平台后，用营养液洗净，待血管环张力恢复到基线，准备进行下一步实验。

药物作用检测：组织灌流系统稳定后，营养液中再加入去氧肾上腺素，终浓度为0.5 mg·L-1，血管条收缩，张力增加，张力曲线上升，待曲线上升平稳后加入待测样品，终浓度分别为1、5、25 μM；另设蒸馏水对照组和DMSO对照组；待曲线稳定后，测量加药前后曲线变化值，即张力变化值。

数据分析：以去氧肾上腺素诱导的血管收缩平稳时的数值为基准，正数代表血管继续收缩，而负数代表血管舒张。

3 实验结果

3.1 对凝血指标的影响

3.1.1 对TT的影响

首先考察了同等体积的DMSO 对体系的影响，发现DMSO 对本体系中TT 有显著延长作用（P＜0.01）；与DMSO 溶剂对照组比较，三七素可剂量依赖性降低血浆TT，500-1000 μM内效果显著（P＜0.01）（图1）。

图1 三七素对TT的影响

3.1.2 对APTT的影响

首先考察了同等体积的DMSO 对体系的影响，发现DMSO对本体系中APTT有显著延长作用（P＜0.01）；与DMSO 溶剂对照组比较，三七素500 和1000 μM 可显著缩短血浆APTT（P＜0.01）（图2）。

图2 三七素对APTT的影响

3.1.3 对PT的影响

首先考察了同等体积的DMSO 对体系的影响，发现DMSO 对本体系中PT有延长的趋势，但统计上无显著性差异（P＞0.05）；与DMSO 溶剂对照组比较，三七素100-1000 μM 可剂量依赖性的缩短血浆PT（P＜0.05，P＜0.01）（图3）。

图3 三七素对PT的影响

3.1.4 对FIB的影响

首先考察了同等体积的DMSO 对体系的影响，发现DMSO 对本体系中FIB 含量有显著降低作用（P＜0.01）；与DMSO 溶剂对照组比较，三七素50-2000 μM以 上 可 剂量 依 赖性 的 增 加FIB 含 量（P＜0.05，P＜0.01）（图4）。

图4 三七素对FIB的影响

3.2 对血小板聚集率的影响

家兔富含血小板血浆中加入三七素可不同程度地诱导血小板聚集。与溶剂对照组比较，三七素1000-2000 μM时可显著增加血小板聚集率（P＜0.05，P＜0.01）（图5）。

图5 三七素对ADP诱导家兔血小板聚集的影响

3.3 对血管平滑肌的影响

与对应的溶剂对照组比较，三七素1 μM 浓度时可显著收缩血管动脉条（P＜0.01），人参皂苷Rb2在5 μM浓度时可显著收缩血管动脉条（P＜0.05），在25 μM时则具有扩张血管的趋势（P＞0.05）（图6）。

图6 人参皂苷Rb2、三七素对PE诱导离体家兔主动脉环收缩的影响

4 讨论

质量是中药产业的生命线，近年来由于中药材品质的影响，国内外业界对中医药的安全性和有效性提出诸多质疑，中药质量成为行业关注的焦点，严重影响了中医药的声誉。中药质量标志物是中药质量标准中的核心要素，是控制中药材、饮片、提取物及制剂内在质量的关键，是中药现代化、国际化的瓶颈之一。刘昌孝院士提出的中药质量标志物是质量评价的核心概念，是以药材基原为研究基础、以物质基础研究为支撑、以Q-markers 辨析为核心、以质控方法为手段，构建符合中药特色的质量控制标准，正逐步成为中药质量控制新模式[17]。

由于中药的功效是在中医药基础理论指导下对中药预防、治疗作用的高度概括。以中药的功效研究为基础，发掘中药的功效标志物对中药现代化也具有重要的意义。进行中药功效标志物的识别，理清其作用机制，网络药理学、系统生物学、系统药理学等新兴学科、交叉学科发展迅速，数据挖掘、分子模拟、生物网络等新兴技术逐渐被引入[18]。本课题前期血清移行成分的分析鉴定了三七超微粉入血的原型成分及代谢产物，并根据原型成分和查阅文献共同确定的化合物进行了网络药理学的分析。结合两者结果，本课题选取了多个单体化合物进行了凝血指标实验、血小板聚集实验、血管平滑肌实验、心肌和血管保护实验、消肿定痛实验等，进行活性化合物的筛选，构建了不同的体外细胞模型、体内动物模型和离体模型，分别得到三七超微粉发挥不同作用的标志性成分，其中包括活血成分和止血成分。本文阐述了止血成分的实验结果。

《本草纲目新编》中记载：“三七根，止血之神药也。”三七的止血功效是学界公认的功效。三七止血一般生用，因三七氨基酸不稳定，经蒸烫炸后易分解。石莹等采用改良的Feeney 自由落体模型制备法建立创伤性脑损伤（TBI）大鼠模型，于术前3 天至术后3 天灌胃三七粉2.5 g·kg-1，结果三七粉能改善72 h 神经功能缺陷评分，同时HE 染色和Nissl 染色脑组织损伤较模型组改善，透射电镜下脑细胞中可见自噬体减少，泛素结合蛋白p62、Beclin1 和微管相关蛋白轻链3（LC3）均明显下降（P＜0.05或0.01），说明干预TBI大鼠自噬过程，能促进脑功能恢复[19]。雷霆等采用高脂高糖饲料喂养、一次性腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，再以磁铁压轧大鼠背部制作溃疡创面造成糖尿病足溃疡（DFU）模型，并给予三七/白及胶海绵纱布覆盖创面进行干预治疗，每1-2 天换药1 次，干预治疗后第3、7 天时，与模型组分别比较，发现三七/白及胶海绵组大鼠创面愈合率显著升高（P＜0.05）；创面组织的炎细胞浸润、胶原纤维沉积、毛细血管和肉芽组织生长均明显增加；β-连环素（β-catenin）、R-脊椎蛋白3（Rspo3）的mRNA 表达水平均有升高，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）的mRNA 表达水平降低（P＜0.05），表明三七/白及胶海绵可有效促进DFU 模型大鼠溃疡创面愈合，作用机制可能与GSK-3β 的mRNA 表达的下调和β-catenin、Rspo3的mRNA表达的上调相关[20]。

止血过程与凝血因子、血小板、血管收缩等有关。凝血是一系列凝血因子相继酶解激活，最终纤维蛋白原激活生成纤维蛋白凝块，使血液由流动状态转变为凝胶状态的过程，包括内源性凝血途径、外源性凝血途径和共同凝血途径（图7）。APTT 是临床上筛选内源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ缺乏的首选实验。有出血症状的单因子缺乏患者及手术和创伤后的异常出血等均需要了解凝血因子的缺乏程度[21]。PT 用于外源性凝血途径的筛选性实验和凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ缺乏的筛选，用于定量测定及口服抗凝剂治疗的监控[22]。TT 测定适用于检验共同凝血途径的筛选试验，反映纤维蛋白原转为纤维蛋白的时间。纤维蛋白原是凝血过程中的主要蛋白质，在凝血酶、血纤维稳定因子（FXⅢa）、Ca2+等凝血因子的作用下形成纤维蛋白单体，并相互共价结合形成纤维蛋白多聚体，形成稳定的纤维蛋白网，最终网罗红细胞（RBC）、血小板（PLT）等成分形成稳定血栓结构。本研究发现三七中的三七素可显著缩短APTT、TT、PT 时间，提高血浆中FIB含量,是三七促凝作用的物质基础。

图7 凝血途径

血小板在正常生理血液中是静息的，血小板活化功能亢进是血栓形成的主要病理机制之一。受多重因素的影响血小板被激活，血小板和纤维蛋白原聚集成团，最终导致血栓形成及血管的闭塞。邝晶等采用脑出血大鼠模型，给予大鼠灌胃三七后大鼠出血量、血肿程度和梗死面积明显比模型组少或减轻，血管组织中血小板活化因子CD62P的表达量明显下调[23]。本实验发现三七素可诱导血小板聚集，是三七促血小板聚集发挥止血作用的物质基础。

人工全髋关节置换（THA）术后会较大量失血，同时关节的积血肿胀增加了术后感染几率，也影响患者的康复锻炼。如何减少THA 术后失血，争取做到不输血是目前关注的焦点。临床上有术中关节腔内注射肾上腺素、术后弹力绷带加压包扎、冰敷等引起血管收缩或造成血管腔变小的方法来减少THA 术后出血。肖署阳等选取人工全髋关节置换术患者30 例，于前1天和术后连续3 天口服三七止血汤，结果显示三七止血汤能显著减少人工全髋关节置换术的总失血量、显性失血量及隐性失血量，输血患者数量和输血量明显降低，可显著减少人工全髋关节置换术围手术期失血[24]。本研究发现人参皂苷Rb2在25 μM浓度时，可显著收缩血管；三七素在1 μM 浓度时，可显著收缩血管，表明人参皂苷Rb2、三七素是三七缩血管发挥止血作用的物质基础。

综上所述，三七止血作用主要表现在促凝血、促血小板聚集、血管收缩等方面。促凝血、促血小板聚集作用的物质基础主要是三七素，缩血管作用的物质基础主要是三七素（图8）、人参皂苷Rb2（图9）。

图8 L-三七素

图9 人参皂苷Rb2