三七粉质量标志物研究＊

张铁军，郭海彪，许 浚，徐 旭，王德勤，韩彦琪，张洪兵，李楚源＊＊，刘昌孝

（1.天津药物研究院/天津市中药质量标志物重点实验室 天津 300301；2.天津药物研究院/中药现代制剂与质量控制技术国家地方联合工程实验室 天津 300301；3.天津药物研究院/释药技术与药代动力学国家重点实验室天津 300301；4.广州白云山和记黄埔中药有限公司 广东 广州 510515）

三七为常用大宗中药材，来源于五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根茎，性温，味甘、微苦，归肝、胃经，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，主要用于治疗外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等[1]。现代药理研究表明其具有止血、活血、抗炎、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、增强记忆力等作用[2]。是具有“多重功效”的代表性中药。三七粉作为三七市场应用的主要形式之一，对于三七粉的质量评判多参考《中国药典》规定指标，三七粉的质量标准主要是测定其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1的含量[1]，不能全面反映三七粉的质量。并且，目前三七粉品牌众多，缺少统一的三七粉质量标准，由于三七成粉后失去了传统评价的性状，给掺假的鉴别和质量评价带来更多的难度。同时，不同于三七药材，三七粉既可作为原料，又是临床以单味使用的主要形式，加之使用人群的需求特点，都决定了三七粉质量研究与质量控制的重要意义。

中药质量标志物（Q-Marker）是刘昌孝院士提出的中药质量控制的新概念[3]，以中药质量标志物“五要素”统领，更能保证中药质量的“有效性”“特有性”“传递与溯源性”特点，反映中医理论的本质内涵，更好地评价和控制中药整体质量。本课题组根据中药QMarkers 基本条件和原则[4-6]，对三七粉的化学物质组及其传递规律进行了系统辨识；应用网络药理学方法、体内、体外模型评价三七粉的活血化瘀、消肿定痛、止血作用及作用机理，明确其药效物质基础；进一步结合成分特有性分析，确定三七粉的质量标志物。在此基础上，建立了基于三七粉质量标志物的“一测多评”多指标含量测定和指纹图谱方法，为优质三七粉的质量标准制定及原料药材的选择提供科学依据。

1 三七粉质量标志物发现研究

1.1 化学物质组系统辨识及传递规律

中药以口服用药的形式通过药物体内传输发挥临床疗效，其功效是化学物质基础经过质量传递和代谢转化后生物效应的综合体现[6]。因此，从中药的有效性角度认识和评价其质量，必须明确体外化学成分组-体内血行成分组的传递-转化过程，能为中药药效物质基础的传递过程提供清晰的路径，也是深入开展其分子作用机制研究的重要依据[7-8]。三七化学成分的辨识及三七皂苷的代谢转化研究已有报道[9-14]，三七粉为三七药材经粉碎加工而成，目前缺乏三七粉化学物质组及其口服后体内血行成分组的表征。本研究运用超高液相色谱-电喷雾/四级杆飞行时间串联质谱联用技术（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）对三七粉所含化学成分进行了全面分析；建立口服给药血浆的血行成分分析方法，分析三七粉口服给药血中移行的原型药物成分及代谢物，明确体外化学成分组-体内血行成分组的药效物质基础传递-转化过程，为三七粉的质量标志物确定与全面质量控制提供依据，也为其深入分子作用机制研究奠定基础。

经与标准品和文献数据比对，分析其质谱裂解规律，结果在三七粉样品中共鉴定得到54 个化学成分，以皂苷类化合物为主，包括原人参二醇皂苷类36 个，原人参三醇皂苷类14 个，黄酮类1 个，糖类1 个，氨基酸类1 个和酯类化合物1 个。通过比对三七粉、大鼠给药血浆及空白血浆样品的色谱图，筛选分析血中移行的原型药物成分及代谢物，结果在大鼠血浆中共鉴定得到18 个三七粉相关的外源性化合物，包括14 个吸收原型药物成分（原人参二醇皂苷类6个，原人参三醇皂苷类6 个，黄酮类1 个，氨基酸类1 个）和4 个代谢物（2 个来源于原人参二醇皂苷类，2 个来源于原人参三醇皂苷类），它们可能是三七粉潜在真正的活性成分，并与三七粉的药理作用直接相关。另外，从质量传递与溯源的角度，血中的效应成分是质量传递体系的最终环节[4]，可为后期三七粉质量标志物的确定提供重要依据。

1.2 有效性的系统表达及药效物质基础及质量标志物发现研究

传统功效（功能主治）是中药有效性的概括，也是临床用药的依据。Q-marker 作为评价和控制中药有效性的主要指标，须与有效性相结合。《中国药典》2020 版一部收录三七具有散瘀止血，消肿止痛的功效。用于咯血，吐血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛。本课题组首先选取了三七中12个入血成分，应用网络药理学方法，分析其作用靶点和信号通路，并进行蛋白间相互作用（PPI）分析以及生物信息学（GO）分析，构建“化合物-靶点-信号通路-药理作用-功效”网络来揭示三七活血止血，消肿止痛的多靶点、多通路协同作用机制。在此基础上，采用CoCl2制备心肌细胞（H9C2）损伤模型，通过观察三七主要成分对心肌细胞成活率、LDH、MDA、SOD 的影响；采用H2O2制备人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤模型，通过观察三七主要成分对内皮细胞存活率、LDH、ACP 的影响，评价其血管保护作用并确定物质基础；采集家兔血浆，采用体外TT、APTT、PT、FIB 检测试剂盒观察三七主要成分对凝血系统的影响评价其活血化瘀作用并确定其药效物质基础；采用小鼠醋酸扭体实验和采用LPS 诱导的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7 炎症模型，评价其消肿定痛作用并确定物质基础；采用体外模型，通过观察TT、APTT、PT、FIB等凝血指标、血小板聚集率、对血管平滑肌的影响，评价其止血作用并确定止血的药效物质基础。

1.2.1 基于网络药理学的三七粉传统功效作用机制预测分析[15]

为了探索三七活血止血，消肿止痛传统功效的网络调控机制。本课题组首先选取了三七粉中12 个入血成分为研究对象，依据反向分子对接的方法预测化合物靶点，借助String 10 数据库与Omicsbean 在线分析软件对靶点进行信号通路分析、基因本体（gene ontology,GO）功能富集分析，最后利用Cytoscape 软件构建网络药理图。结果显示：12个化合物可通过65个相关靶点作用于65条信号通路，主要涉及抑制血栓生成、纤溶、血管新生、舒张血管、凝血、抗炎以及镇痛等方面，进一步得到三七“化合物-靶点-通路-药理作用-功效”的网络图。

根据网络药理学预测并结合文献分析，人参皂苷Re 与Rk1分别通过增加胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平[16]和下调环氧酶（COX）的活性[17]来抑制血小板聚集，进而阻碍血栓形成。三七皂苷R1[18]、人 参皂 苷Rg1[19]、Re[16]、Rg3[20]、Rb1[21-22]、槲皮素[23]等化合物可增加内皮一氧化氮（NO）水平，舒张血管，缓解血栓形成。另外，三七皂苷R1[24]、人参皂苷Rg1[19]、Rg3[25]、Rb1[26]、Re[27]等能够增加血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进血管新生，保护血管内皮；三七素可作用于凝血酶（F2）、凝血因子X（F10）等蛋白，激活凝血因子，使血液凝固；还能使血小板发生伸展伪足、聚集、变形，从而诱导释放腺苷二磷酸（ADP）、血小板因子和Ca2+等物质，缩短凝血时间，增加血小板数目，达到止血的效果；并且能通过降低血浆NO 水平以及增益组织胺来增 强 血 管 收 缩[28-29]；三 七 皂 苷R1[30]、人 参 皂 苷Rg1[31]、Re[32-33]、Rk1[34]、Rg3[20]、槲皮素[35]等可作用于IL-1β、IL-6等相关蛋白，下调炎症因子的表达，抑制核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，从而减轻炎症状态，抑制炎性水肿。人参皂苷Rb1[36]、Rd[37]、Rh1[38-39]、Rk1[40]等作用于COX-2、前列腺素E 合成酶（PTGES）等蛋白，抑制前列腺素的合成，发挥抗炎镇痛作用。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Rb1、F2、Rg3、Rd[34]等化合物可激活阿片受体发挥中枢神经镇痛作用。

1.2.2 基于活血作用的三七质量标志物研究

为了研究和确定三七活血作用的质量标志物。本课题组采用体外TT、APTT、PT、FIB检测试剂盒观察三七主要成分对凝血系统的影响；收集家兔富含血小板血浆，以ADP 诱导血小板聚集，观察三七主要成分对血小板聚集率的影响；取家兔主动脉条，置于体外组织灌流系统中，以去氧肾上腺素诱导血管条收缩，观察三七主要成分对血管平滑肌收缩功能的影响。结果显示：人参皂苷F2、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rk1、三七皂苷R1、人参皂苷Rg2，可显著延长TT（P＜0.05，P＜0.01）；人参皂苷F2、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb1、槲皮素在可延长APTT（P＜0.05）；人参皂苷Re、槲皮素、人参皂苷F2、人参皂苷Rb3，可显著延长PT（P＜0.05）；槲皮素、人参皂苷F2、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、三七皂苷R1、人参皂苷Rg2可显著降低血浆FIB 含量（P＜0.05）；人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、三七皂苷R1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1可显著降低ADP诱导的血小板聚集（P＜0.05）；人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rk1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg2可明显扩张血管动脉条（P＜0.05，P＜0.01）。

综上所述，三七活血作用表现在抗凝、抗血小板聚集、扩血管等方面，通过抗凝、抗血小板作用来防止血栓形成；通过扩张血管增加血流量。上述结果提示：三七可通过改善血液流变学性质、血液凝聚状态以及血流动力学从而发挥其活血散瘀作用，用于治疗心脑血管系统疾病以及外伤瘀血肿痛等疾病，其主要活性成分包括槲皮素、三七皂苷R1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg2，人参皂苷F2人参皂苷Rg3、人参皂苷Rd等。

1.2.3 基于心血管保护作用的三七质量标志物研究

三七常用于心脑血管疾病，心肌、血管的保护作用是该类药物发挥临床功效的主要作用机制。本课题组采用CoCl2 制备心肌细胞（H9C2）损伤模型，观察三七主要成分对心肌细胞成活率、LDH、MDA、SOD 的影响；采用H2O2 制备人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤模型，观察三七主要成分对内皮细胞存活率、LDH、ACP 的影响。结果显示：人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rd、槲皮素、人参皂苷F2、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rh1、三七素能够显著增加H9C2 细胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），多个成分能够减少LDH、MDA，增加SOD；三七皂苷R1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、槲皮素、人参皂苷F2、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rh1、三七素可显著提高HUVEC 细胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），多个成分能够减少LDH、ACP。表明人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rd、槲皮素、人参皂苷F2、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rh1、三七素是三七发挥心脏保护作用的物质基础；三七皂苷R1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、槲皮素、人参皂苷F2、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rh1、三七素是三七发挥血管保护作用的物质基础。

1.2.4 基于消肿定痛作用的三七超微粉质量标志物研究

三七常用于跌打损伤，具有消肿定痛作用。本课题组采用小鼠醋酸扭体模型评价三七超微粉和三七总皂苷的镇痛效果。研究发现，三七超微粉可剂量依赖性的降低醋酸诱导的小鼠疼痛反应，表现在降低小鼠的扭体产生次数。三七总皂苷为三七中富含皂苷成分的提取物，也可以剂量依赖性的降低小鼠扭体次数，表明三七总皂苷为三七镇痛的有效部位。进一步以LPS 诱导的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7 炎症模型对三七总皂苷及14个关键化学成分（包括原人参三醇型：三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1；原人参二醇型：人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷F2、人参皂苷Rk1；黄酮类：槲皮素以及氨基酸类：三七素）进行了体外抗炎活性评价。结果显示：三七总皂苷及14 个化合物能显著降低LPS 诱导的RAW264.7 细胞上清液中NO、TNF-α 和IL-6 的含量，显示较好的抗炎效果，推测以上14个化合物可能为三七超微粉发挥消肿定痛作用的关键药效物质基础。

1.2.5 基于止血作用的三七质量标志物研究

三七具有止血作用，但其止血作用的物质基础未见系统研究。本课题组为全面表征三七的质量属性，确定其质量标志物，对其止血作用的物质基础进行了研究。网络药理学研究表明：三七素可作用于凝血酶（F2）、凝血因子X（F10）等蛋白，激活凝血因子，使血液凝固；还能使血小板发生伸展伪足、聚集、变形，从而诱导释放腺苷二磷酸（ADP）、血小板因子和Ca2+等物质，缩短凝血时间，增加血小板数目，达到止血的效果；并且能通过降低血浆NO 水平以及增益组织胺来增强血管收缩[27-28]。本课题组在此基础上，进一步进行验证研究。在兔血浆中分别加入三七素样品，采用凝血记录仪，依据试剂盒说明书，测定TT、APTT、PT、FIB；在兔富含血小板血浆中加入三七素药物样品后，再加入诱导剂ADP，采用比浊法，测定血小板聚集率；取离体兔主动脉条，体外组织灌流，以去氧肾上腺素诱导动脉条收缩，分别加入三七素、人参皂苷Rb2，观察血管条张力变化值。结果显示：三七素500-1000 μM 是可显著降低血浆TT、APTT，100-1000 μM 显著缩 短 血 浆PT，50-2000 μM 可 显 著 增 加FIB 含 量；1000-2000 μM 时可显著增加血小板聚集率；三七素1 μM 浓度时，人参皂苷Rb2在25 μM 浓度时可显著收缩血管动脉条。表明三七素是三七促凝、促血小板聚集发挥止血作用的物质基础；三七素、人参皂苷Rb2 是三七缩血管发挥止血作用的物质基础。

1.3 化学成分的特有性分析

上文研究明确了三七化学物质组及其传递规律，并根据该药的散瘀止血、消肿定痛功效，对其药效物质基础及作用机理进行了系统阐释，为该药的质量标志物的确定奠定了基础。按照质量标志物的定义和确定原则，“特有性”是重要因素，三七与人参、西洋参等著名药材均来源于五加科人参属植物，但功效迥异。成分特有性是功效差异的物质基础，是质量评价的重要依据。

三七来源于五加科人参属PanaxL.，人参属植物主要分布于北美洲东部和亚洲东部，在中国有6个种，3个变种，多数分布于东北、云南、四川、广西、江西、陕西等地。人参属植物发源于第三世纪古热带山区，属东亚-北美间断分布的植物区系成分，该属植物的现代分布中心从东喜马拉雅至我国西南地区，特别是云南西北部则是以假人参Panax pseudoginsengWall.和竹节参Panax japonicus(T.Nees) C.A.Mey.为核心的近代分化中心，随着海拔和纬度的变化分化出多种内变异类型。

结合形态特征及化学成分，人参属划分为两大类群：第一类群被认为是古老类群，典型植物有人参Panax ginsengC.A.Mey、西洋参Panax quinquefoliusL.、三七；第二类群被认为是进化的类群，典型植物有竹节参、姜状三七。假人参在形态上属于第一类群，但在化学成分上与第二类群相一致，是过渡类群。

有文献提出[41]，人参属古老类群的特征性成分组包括：（1）氨基酸-三七素；（2）以达玛烷型四环三萜皂苷为主的皂苷成分。其中三七素、皂苷类成分是三七主要活性成分，且皂苷类成分含量较高。

三七皂苷类成分主要为人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1等达玛烷型四环三萜皂苷。目前，达玛烷型四环三萜皂苷的生物合成途径已有初步的认识，研究认为植物达玛烷型四环三萜皂苷主要通过乙酸/甲羟戊酸途径[42]（MVA pathway）（图1）。一般可分为3个阶段：①合成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）；②由异戊烯基转移酶和萜类环化酶催化IPP 和DMAPP 形成2,3-氧化鲨烯；③2,3-氧化鲨烯依次经过环化、羟基化、糖基化修饰后最终形成三萜类皂苷，但糖基化步骤仍有待鉴定。从成分的特异性分析来看，三七中的四环三萜皂苷类成分处于生源途径的下游位置，特异性较强，三七特有的皂苷类成分有三七皂苷R1、R2、R4、R6等。

图1 三七达玛烷型四环三萜皂苷生物合成途径

综上所述，通过对三七分的化学物质组及口服血行成分的系统辨识、活血、止血及消肿止痛药效物质基础的研究，并结合成分特有性分析，确定三七粉的质量标志物为：三七素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rd。

2 基于质量标志物的三七粉质量标准提升研究

目前，《中国药典》2020 年版三七（三七粉）项下仅规定了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量要求，不能全面评价和控制其散瘀止血、消肿定痛的功效。为了建立科学的质量评价和质量控制方法，全面评价三七粉的整体质量，本课题组通过系统研究，确定了三七素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rd 为三七粉的质量标志物，在此基础上，采用“一测多评”等分析方法，对三七素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rd 进行含量测定，对不同三七粉及不同商品规格原料药材进行质量标志物差异分析。建立指纹图谱，采用新的相似度计算模型-等同系数法和模式识别对三七粉及原料药材进行质量一致性评价。结果显示：三七素为广州白云山和记黄埔三七粉的优势指标，原料药材中三七素和皂苷含量与头数关系不大，但与季节、部位具有相关性进一步结合化学模式识别实现了不同规格原料药材的区分。

本课题建立的含量测定及指纹图谱方法稳定可行，专属性强，具有较强创新性，对于控制三七粉质量具有显著意义。与2020年版《中国药典》相比，该文修订了三七粉含量测定项，增加了HPLC 指纹图谱项，可为优质三七粉的质量标准制定及其原料药材的选择提供科学依据。

3 讨论

3.1 “多重功效”是中药有效性表达的普遍现象，表现为“一物多效”“一物多性”。

这是由中药的复杂的化学物质基础所决定的。也为中药临证配伍提供了更多的灵活性。同一药材针对不同疾病可发挥不同的疗效，同一药味在不同方剂中可以起到不同的作用。从疾病的生物学角度，外源性药物成分亦存在“有故无殒”“补之不足、损其有余”的规律。中药质量评价是对其有效性的系统表征，应对其“多重功效”进行系统表达，评价和控制整体质量。

3.2 三七具有典型的“多重功效”，既可活血、又能止血，还有消肿定痛的作用。

现行标准中仅规定了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量要求，难以反映其“多重功效”的特点。本课题组研究在阐明三七粉活血和心肌、血管保护作用的物质基础上，又发现：三七素是其止血作用的主要药效物质基础；三七粉中原人参三醇型成分三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1；原人参二醇型成分人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷F2、人参皂苷Rk1；黄酮类成分槲皮素以及氨基酸类成分三七素为其消肿定痛的药效物质基础。

3.3 成分的“可测性”是建立质量评价和质量控制方法的必要条件。

本课题组在确定质量标志物的基础上，建立了“一测多评”等分析方法，对三七素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rd 进行含量测定。建立了三七粉的指纹图谱，对其质量标准进行了提升。并对不同入药部位、不同采收时间、不同商品规格的多批次三七样品进行测定，为三七分质量评价提供了实验证据。

本课题组基于三七粉有效性完整表达、化学物质组的传递与溯源以及成分特有性分析等方面的系统研究，确定了三七粉的质量标志物，进步建立基于质量标志物的多指标成分含量测定及指纹图谱方法，为其质量评价和质量控制提供了理论与实验证据。