肺泡灌洗液宏基因组二代测序对疑似肺结核的诊断价值

赵素娥 高欣 刘胜岗 龙静 周丽华

肺结核是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的呼吸系统传染病，我国肺结核发病率及死亡率位居所有传染病首位，为全球第2位[1]。控制结核病的关键环节是控制传染源，因此肺结核患者的早发现、早诊断显得尤为重要。传统的罗氏培养方法周期长，阳性率低，不能满足临床快速诊断的需要。近年来，宏基因组二代测序技术(metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS)发展迅速，它能对微生物的DNA或RNA进行快速测序的技术，对感染性疾病的诊断具有一定的价值[2-4]。本研究对同期进行MTB痰涂片和培养，肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)涂片和培养、荧光定量PCR、Xpert MTB/RIF(简称Xpert)及BALF mNGS检测的患者进行回顾性分析，旨在探讨BALF mNGS检测对肺结核早期诊断的价值。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2020 年5月22日至2021年2月20日长沙市中心医院收治、同步行痰液及BALF抗酸染色涂片法、MTB培养法，BALF TB-DNA或Xpert检测及BALF mNGS的疑似肺结核患者，且尚未使用抗痨药物。排除标准：年龄在18岁以下、近期有抗结核治疗史、临床资料不完整、未同时进行抗酸染色涂片法、MTB培养法及mNGS检测、诊断不明确者。最终纳入155例，男106例，女49例，年龄(59.05±16.45)岁。根据临床诊断标准，最后诊断为肺结核95例(肺结核组)，男72例，女23例，年龄(59.30±16.46)岁；诊断为非肺结核60例(非结核组)，其中感染性疾病54例，嗜血细胞综合征1例，恶性肿瘤5例，男34例，女26例，年龄(58.66±16.58)岁。本研究通过长沙市中心医院伦理委员会批准(批件号：2021-S0197)。

肺结核诊断标准参照《肺结核诊断》(WS 288-2017)[5]，临床诊断标准为：(1)结合影像特征和结核免疫学检测阳性，排除其他疾病，且抗结核药物治疗经评估有效。确诊标准：(2)具有病原学或者病理诊断依据，或采用现代分子生物学检测手段(PCR法、基因检测等)结合临床资料等进行综合分析的确诊患者。

二、标本采集

采用日本产Olympus BF-260型电子支气管镜灌洗病变肺段，重复灌洗肺部2～3次，收集肺泡灌洗液。

三、检测方法

1 常规MTB检查方法 涂片按照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》中的 标准化操作程序，采用美国BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪，具体操作方法参照仪器说明书。

2 荧光定量PCR检测 运用博奥生物有限公司核酸提取仪提取肺泡灌洗液的结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)，然后运用美国ABI-7500基因扩增仪检测，具体操作参考试剂说明书。

3 Xpert MTB/RIF检测 Xpert MTB/RIF按照美国Cepheid公司生产的利福平耐药实时荧光定量核酸扩检测系统仪器使用说明书进行操作。

4 宏基因组二代测序技术检测 取肺泡灌洗液5 mL以上，送至湖南圣维尔医学检验中心检测，进行核酸提取及建库和上机测序，最后进行生信分析及报告，分析流程为：①过滤原始数据中低质量序列及接头序列，②初步质控后数据，③去人源及常见背景微生物序列，④比对微生物数据库(来源：NCBI-RefSeq&Genbank数据库(12800+种)，细菌6600种，真菌980种，病毒5000种，寄生虫222种，分支杆菌171种，支原体/衣原体97种)，⑤依据比对情况进行二次过滤，对种属信息进行统计(NCBI-nt数据库二次比对，与阴性control集进行比较去除假阳性物种)，⑥最终结果列表。

mNGS报告的解读依据《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》简称《中国专家共识》[6]，符合下列标准：①若二代测序结果符合患者的临床表现和其他实验室检查，推荐根据二代测序结果指导临床决策。②若二代测序结果阳性且符合临床表现，但缺乏除二代测序结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证(在具有合适引物的条件下)，并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证。③若二代测序结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅根据二代测序结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。MTB为胞内致病菌，丰度较低，污染可能性小，当至少1个读数被映射到种或属水平时，MTB被认为是阳性的[7]。

四、统计学处理

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料采用“例”和“率(%)”表示；最终临床诊断为参考标准，计算常规检测方法与BALF mNGS在肺结核中的敏感度，特异度，阳性预测值，阴性预测值；组间比较采用 χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、实验室检测结果

95例肺结核组中，BALF mNGS检出MTB阳性55例。肺结核组中，24例(25.26%)合并真菌感染(包括5例耶氏肺孢子菌)，以白色念珠菌居多，40例(42.11%)合并细菌感染(见表1)。非肺结核患者60例，以肺部感染和支气管扩张合并感染多见(见表2)。

表1 肺结核组病原菌种类及占比

表2 非肺结核组病种及占比

二、mNGS MTB检测阳性者最终均诊断为肺结核，无假阳性；真菌或细菌检测阳性者

根据临床、实验室、影像学和痰液/肺泡灌洗液培养结果综合判断后进行临床干预。肺结核组中，mNGS及传统方法(痰及BLAF)共诊断24例合并真菌感染(包括5例耶氏肺孢子菌感染)，均合并2种及以上病原菌感染，且均入住结核ICU，并进行了针对性的抗真菌治疗。肺结核组中，mNGS及传统方法(痰及BLAF)共诊断40例合并细菌感染，其中mNGS及传统方法一致者11例，mNGS检出病原体而传统方法未检出者19例，传统方法检测出而mNGS未检出者10例。38例进行了针对性的抗感染治疗，2例仅使用抗痨药物。

非结核组60例，5例恶性肿瘤患者进行了化疗或靶向治疗及参考病原学进行抗感染治疗。嗜血细胞综合征1例转血液科继续治疗。5例非结核分枝杆菌肺病，3例进行抗NTM治疗，2例要求转上级医院治疗。其他合并细菌或真菌感染者参考mNGS结果进行了治疗。

三、mNGS诊断肺结核的阳性率与常规检测方法的比较

以最终临床结果为参考标准，mNGS诊断肺结核的阳性率为57.89%(55/95)，高于痰抗酸染色涂片法(27.37%，26/95)和痰快培法(30.53%，29/95)，也明显高于BALF抗酸染色涂片法(15.79%，15/95)和BALF快培法(20.00%，19/95)，差异均有统计学意义(P<0.001)；但与BALF Xpert(58.33%，21/36)相比，差异无统计学意义(P=1.00)；略高于BALF TB-DNA(50%，31/62)，差异无统计学意义(P=0.09)(见表3)。

表3 mNGS与常规检测方法阳性率比较

四、mNGS诊断肺结核的效能与常规检测方法的比较(见表4)。

表4 mNGS与常规检测方法效能比较

讨 论

肺结核是严重危害人类健康的公共问题，早期诊断并及时治疗对控制肺结核的传染性尤其重要。罗氏培养法为经典的诊断肺结核的“金标准”，但培养周期长，约4～6周，阳性率低。涂片抗酸染色法简便、快捷，但阳性率亦低。对于无咳痰或痰液含菌量少的患者，支气管肺泡灌洗液(BALF)抗酸染色涂片及快培成为辅助诊断肺结核的重要工具，但BALF抗酸染色检测结核杆菌要求标本浓度较高，研究显示[8]，BALF抗酸染色涂片阳性率为15%，诊断价值有限。

随着分子生物学技术迅速发展，PCR是近年新发展的分子与基因相结合的方法，具有较高的灵敏度和特异度，能快速、准确地诊断肺结核[9]。TB-DNA检测技术是通过对DNA片段进行放大扩增，并借助荧光标记探针对结核杆菌DNA扩增序列进行定量检测的一种检测方法。2018年实施的结核病诊断“新标准”增加了TB-DNA检测作为结核病诊断新指标[5]。而Xpert检测技术是半巢式实时荧光定量 PCR技术优化，可通过检测结核分枝杆菌特有的序列rpoB基因与利福平耐药相关的81 bp核心区间[10-11]，能准确、有效检出结核分枝杆菌和利福平耐药的情况，且其检测时间明显缩短。TB-DNA和Xpert检测肺结核有较高的诊断价值，但肺结核患者多为混合感染，尤其对于危重症患者，二者不能检测其他病原体。

mNGS不基于培养，直接从环境/临床样本中提取全部微生物的核酸，利用基因组学的方法研究环境/样本中所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能，可广泛分析临床样本中微生物组(细菌、真菌、病毒、结核等)的高通量测序方法。该技术可准确检测出标本中的MTB[12-13]。回顾性研究显示其诊断肺结核的敏感度为59%，显著高于培养法(26%)[8]。本研究结果显示，BALF mNGS诊断肺结核的敏感度为57.89%，显著高于痰涂片法、痰培养法及BALF涂片法及BALF培养法，特异度100%，这与研究一致。这里BALF涂片法及培养法诊断肺结核的敏感度低于痰涂片法、痰培养法，考虑可能与标本浓度稀释有关，提示我们，有自主咳痰能力的患者尽量多次送检痰涂片或培养。既往研究显示，对于呼吸道样本，mNGS对于结核分枝杆菌的检出率并不优于GeneXpert[14]。本研究显示BALF mNGS诊断肺结核的阳性率与BALF Xpert(58.33%，21/36)和BALF TB-DNA(50%，31/62)相比，差异无统计学意义。原因考虑为结核分枝杆菌细胞壁比较厚[15]，破壁困难，常规核酸提取方法难以保证核酸提取的质量。

《中国专家共识》[6]指出，各种原因导致患者急危重症表现，不除外感染所致，或考虑继发或并发危及生命的严重感染，建议常规检测的同时，开展mNGS。95例肺结核患者，共35例入住结核重症监护室，13例行气管插管，10例合并脓毒症休克。mNGS检测出2种及以上病原体者63例(66.32%)，24例(25.26%)合并真菌感染，17例仅抗痨治疗，82.11%(78/95)为混合感染，根据病原学进行了治疗调整。提示在危重症感染患者或考虑存在混合感染的病例中，mNGS可提供准确的病原菌诊断信息，减少了临床经验性广谱抗生素的使用，可以快速、准确地指导治疗。

综上所述，BALF mNGS诊断肺结核的敏感度、特异度和阳性预测值显著高于涂片法及培养法，但与BALF TB-DNA及BALF Xpert的阳性率比较无统计学差异。提示我们，对于轻症疑似肺结核患者，不建议行mNGS检测；对于疑难危重疑似肺结核患者mNGS为一种快速、全面检测病原体的诊断方法。