医院碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药特征分析

孙胜君，张昌莲，赵自云

(1.烟台市烟台山医院 检验科，山东 烟台264000;2.山东省荣成市人民医院 输血科，山东 荣成264300;3.青岛市中心医院 检验科，山东 青岛266042)

肺炎克雷伯菌(KP)是医院内仅次于大肠埃希菌的第二大条件致病菌[1]，可引起肺炎、脑膜炎、败血症等疾病。碳青霉烯类药物由于具有较广且较强的抗菌活性，已成为治疗重症感染的最后一道防线药物。但随着碳青霉烯类药物在临床的长期使用，碳青霉烯耐药肠杆菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)尤其是碳青霉烯耐药KP(Carbapenem-resistantK.pneumoniae,CRKP)已在全球多个国家出现[2-3]。在我国，KP对碳青霉烯类药物的耐药率约为11%[1]。KP对碳青霉烯类药物耐药主要是由产KPC-2型碳青霉烯酶引起的。近年来，产NDM型金属酶的CRKP菌株开始呈现[3]。由于细菌耐药具有地域性，不同地域细菌的耐药性不同，所携带的碳青霉烯耐药基因可能也不同，不同组织样本细菌的耐药等特性也不尽相同。随着临床中CRKP检出率的升高，了解本地区CRKP的耐药谱和耐药基因型等特性，可指导临床医生正确选择抗菌药物减少抗菌药物的滥用，也可减少多重耐药CRKP的出现，降低医院内获得性感染的发病率和死亡率。为了解本地区不同组织来源CRKP菌株的耐药情况和流行特征，本研究对临床分离的CRKP耐药表型进行总结分析，并检测了菌株的碳青霉烯耐药机制和分子分型，为临床抗感染治疗提供流行病学资料。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集2017年5月至2021年4月部分住院患者痰液、尿液和血液感染性标本，剔除同一患者的重复菌株。

1.2 细菌鉴定及药敏试验

参照《全国临床检验操作规程》进行细菌的分离、培养，菌株鉴定和药敏试验采用VITEK-2compact全自动细菌鉴定/药敏系统进行测定，共获得了55株CRKP。测定了CRKP菌株对18种抗菌药物的敏感性，其中头孢哌酮采用纸片法进行测定，药敏结果按文献[4]进行判读，替加环素耐药折点参照欧洲药敏试验委员会2017年版标准(http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.3 碳青霉烯耐药基因检测

通过水煮法提取CRKP菌株的DNA,保存于-20℃备用，根据碳青霉烯酶及金属酶相关基因(blaKPC-2，blaIMP，blaSPM，blaAIM，blaVIM，blaOXA，blaGIM，blaBIC，blaSIM，blaNDM和blaDIM)引物序列及PCR反应体系对CRKP菌株进行PCR检测，扩增条件为95℃预变性5 min,(95℃,30 s+52℃,40 s+72℃,50 s)×35个循环，72℃再延伸5 min。扩增产物在100V电压下用2%琼脂糖电泳1小时。经电泳鉴定的PCR 产物送至青岛派森诺基因科技有限公司测序，测序结果提交NCBI进行blast序列比对确认目的基因。

1.4 CRKP的MLST分析

在55株CRKP菌株中，随机挑选27株进行多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)，分析CRKP菌株的亲缘关系和流行亚型，即对KP的7个管家基因rpoB，gapA，mdh，pgi，phoE，infB和tonB进行PCR检测[5]。PCR产物送青岛派森诺基因科技有限公司测序，7个管家基因序列分别提交至Institute Pasteur’s MLST数据库 (https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef&page=sequenceQuery)确认菌株的MLST亚型。

1.5 统计方法

使用Excel对数据进行录入，采用SPSS 17.0软件，计数资料用(百分率)表示，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株来源

2017年5月至2021年4月收集的CRKP菌株剔除重复后共获得菌株55株，其中来自尿液标本14株，占25.5%，痰液标本31株，占56.4%，血液标本10株，占18.2%。

2.2 CRKP菌株药敏试验结果

55株CRKP菌株对亚胺培南和美罗培南两种碳青霉烯类药物均耐药。从表1可以看出，CRKP对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮、阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林、头孢西丁、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟和氨曲南9种β-内酰胺类药物或β-内酰胺类-酶抑制剂的耐药率均达到98.2%。在氨基糖苷类药物中，CRKP对阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别为54.5%和74.5%。在氟喹诺酮类药物中，CRKP对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均高于74.5%以上，受试菌株对复方新诺明的耐药率也达到了69.1%。55株CRKP中并未发现替加环素和多黏菌素耐药的菌株。

分别来自尿液、痰液和血液的CRKP对包括碳青霉烯类药物在内的11种β-内酰胺类药物的耐药率均在96.8%以上，且这11种β-内酰胺类药物的耐药率在三种来源CRKP中并无显著性差异。此外，三种来源CRKP对氨基糖苷类药物、环丙沙星、复方新诺明、替加环素和多黏菌素6种药物的耐药率也无显著性差异。值得注意的是，血液来源CRKP对左氧氟沙星的耐药率已达100%，且显著高于痰液CRKP的耐药率61.3%(P<0.05)，而与尿液CRKP对左氧氟沙星的耐药率85.7%并无显著性差异(表1)。

表1 不同标本来源CRKP菌株的耐药率结果

在55株CRKP中，有多达45株(81.8%)表现为多重耐药，且以β内酰胺类-氨基糖苷类-氟喹诺酮类-复方新诺明四重耐药(45.5%)和β内酰胺类-氨基糖苷类-氟喹诺酮类三重耐药(27.3%)表型最为流行(表2)。55株CRKP中只有2株菌仅对β-内酰胺类药物耐药。

表2 CRKP菌株的多重耐药情况

2.3 碳青霉烯耐药基因及分子分型

55株CRKP菌株全部携带碳青霉烯耐药基因，其中blaKPC-250株(90.9%)最为流行,5株菌中检测到blaNDM，并未发现同时携带blaKPC-2和blaNDM的菌株，也并未发现其他碳青霉烯耐药基因。blaKPC-2在痰液、尿液和血液CRKP中均是流行基因型，blaNDM只在尿液和痰液CRKP中有检出且痰液CRKP菌株中blaNDM的流行率达12.9%(表3)。

表3 不同样本类型CRKP中碳青霉烯耐药基因携带率

在随机挑选的27株CRKP中，有25株已确定MLST型，共获得10种不同的亚型。在确认的10种MLST亚型中，ST11、ST23和ST15型最为流行，检出率分别为22.2%、22.2%和14.8%。ST1083、ST35、ST17、ST2004和ST432检出率较低，分别只在一株菌中检出(表4)。

表4 27株CRKP菌株中各MLST亚型分布

3 讨论

目前，细菌感染的检测是临床微生物实验室中很重要的工作，细菌培养和药敏试验结果对指导临床抗感染治疗至关重要。本文研究了55株CRKP的药敏及耐药特征，该55株CRKP菌株对包括碳青霉烯类和头孢菌素类药物在内β-内酰胺类药物均耐药，这对全部β-内酰胺类药物在临床中的应用构成了极大的威胁。菌株对环丙沙星和左氧氟沙星耐药率均高于70%以上，这严重影响了氟喹诺酮类药物在CRKP感染中的治疗作用，菌株对氟喹诺酮类药物的高耐药率可能与该类药物在临床中的长期使用引起喹诺酮耐药决定区的突变有关[6]。本研究中CRKP菌株对阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别高于54.5%和74.5%，这可能与菌株产生钝化酶有关。多黏菌素和替加环素是治疗革兰阴性菌引起感染的最后防线药物[7]，本研究中CRKP菌株对多黏菌素和替加环素均100%敏感，因此，在治疗CRKP引起的感染中可选用这两种药物进行治疗。

本研究在55株CRKP菌株中全部检测到碳青霉烯耐药基因，其中KPC-2型和NDM型酶是本地区CRKP的主要碳青霉烯酶，这与我国其他地区肠杆菌对碳青霉烯耐药的研究结果类似[3]。但这一结果与欧洲国家CRE中碳青霉烯酶的流行情况不同，在欧洲国家中只有71%的CRE菌株携带碳青霉烯酶[8]。本研究中CRKP的MLST型呈现多样性，但以ST11型和ST23型为CRKP的主要亚型，ST11型CRKP也是目前全球包括我国在内的主要流行亚型[3]，但ST23型在我国有增多的趋势，也成为某些地区CRKP的主要亚型[3]。

综上所述，临床标本中分离的CRKP耐药严重，常表现为多重耐药，其对碳青霉烯耐药主要是由KPC-2酶引起的。但近年来NDM型酶也逐渐增多，同时，CRKP的MLST型呈现多样性。因此，我们要密切关注KP的耐药表型和基因型的变化，多为临床抗感染提供有价值的信息，共同应对细菌性感染性疾病的挑战。