HPV E6/E7 mRNA在宫颈癌早期筛查与诊断的应用研究

张 明，黄旋妹，刘和录

(深圳市中西医结合医院，广东 深圳518104)

宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的恶性肿瘤，在女性常见癌症中排第4位[1]。全球每年约有53万宫颈癌新增病例，死亡人数超过27万，其中有85%发生在卫生资源欠缺的发展中国家，2018年我国约有10.6万例女性被诊断为宫颈癌，死亡病例高达4.8万例，新增病例和死亡病例逐年上升，宫颈癌已严重危害女性的健康[1-2]。正常宫颈上皮细胞通过宫颈上皮内病变逐步发展为宫颈癌，其中高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是引起宫颈癌的必要条件[3]，如果能通过早期筛查和诊断，在癌前病变阶段进行治疗，有98%的病例是可以治愈，而一旦疾病发展为癌并扩展至其他器官，女性的5年生存率不超过17%[4]。由于HR-HPV检查和细胞学检查对宫颈癌前病变阳性预测值低至44%，且HR-HPV检查特异度不高[5]，往往给患者带来心理恐惧或过度检查。从过往的研究看，HPV阳性宫颈癌病例的发生与HPV基因组整合到宿主基因组有关[6]，E6和E7基因DNA的整合和蛋白的失调表达是HR-HPV病毒导致宫颈病变的重要原因[7-9]。先前的研究表明，HPV DNA检查相比于HPV mRNA检查特异性较低，而细胞学检查也存在一定的滞后性和漏诊率[10-11]，因此，检测作为癌基因表达指标的HPV E6/E7 mRNA 用于早期筛查和诊断宫颈癌在理论上优于直接检测HPV DNA和细胞学检查。

目前，检测HPV E6/E7 mRNA 的方法有多种，包括原位杂交、荧光定量PCR等方法，原位杂交技术无法自动化和高通量检测，且需要人工判读结果，易受主观因素影响，qPCR需要提取mRNA模板和指数级放大检测信号，其稳定性差且易污染造成假阳性结果。有学者采用流式细胞术检测宫颈脱落细胞HPV E6/E7 mRNA 取得成功并克服了传统方法的不足[12]。因此，本研究通过流式细胞术研究HPV E6/E7 mRNA和宫颈病变的发生发展及相关性，为宫颈癌的早期筛查和诊断提供新的手段。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2018年至2019年深圳市中西医结合医院宫颈上皮瘤变CIN Ⅱ 11例，CIN Ⅲ 15例，宫颈癌样本18例以及正常对照样本16例。该研究中所有样品均获患者知情同意和深圳市中西医结合医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1HPV E6/E7 mRNA表达水平的检测 (1)样本黏液液化及样本的制备：采用含有消化黏蛋白和RNA酶抑制剂的保存液，在10 min内液化样本使宫颈脱落细胞重悬并防止其降解。(2)细胞固定：采用细胞固定液，使其在30 min内迅速完成固定过程，且达到检测要求的固定效果。(3)细胞通透：在常规皂素通透剂的基础上进行工艺和配方优化，选择合适的浓度及通透缓冲液，使荧光标记的分子信标自由出入于固定好的细胞。(4) 检测探针设计及荧光标记技术：通过文献查阅、基因转录文库的序列分析、分子信标的杂交性能评价等过程后，选择评分高的3组序列，外送专业公司进行序列合成及荧光素标记。最后通过流式细胞检测进行效果评价后确定。(5) 流式细胞仪检测荧光信号：正确调整阈值排除碎片干扰，正确进行颜色补偿，以校正荧光染料光谱之间叠加所造成的误差。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA 阳性率的判断 (1)每个样品脱落细胞数量大于1000个为合格样品;(2)阳性样本的判断原则：每个样本中阳性细胞占该样品中所有细胞的比例大于2%即判定为阳性样本。

1.3 统计学方法

采用Graphpad prism 5软件进行数据处理。各项数据采用χ2检验或Fisher确切概率法进行分析。P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV E6/E7 在宫颈癌病变中的表达

通过流式细胞术检测正常对照样本和宫颈不同程度病变样本中HPV E6/E7 mRNA水平的变化，结果显示HPV E6/E7 mRNA 的表达在正常对照组和宫颈病变样品中具有显著差异，这表明HPV E6/E7具有作为宫颈病变预测和诊断的分子标志物的潜力,见图1。

图1 HPV E6/E7 mRNA在正常对照和宫颈病变样本中的表达情况

为了进一步了解HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变不同组中的表达情况，对不同样本中的HPV E6/E7 mRNA的数据进行分析，结果表明HPV E6/E7 mRNA在正常组、CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组以及宫颈癌组的阳性表达率分别为18.8%、72.7%、80%及88.9%(χ2=21.33，P<0.0001)。HPV E6/E7 mRNA的表达情况：CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组以及宫颈癌组都高于正常组(P<0.05);CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组以及宫颈癌组三组间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组HPV E6/E7 mRNA的表达比较

2.2 ROC曲线评估HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变中的诊断价值

为了分析HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变中的诊断价值，将各组别的阳性率进行ROC曲线分析，随后使用ROC曲线下的相关区域面积(AUC)来评估其诊断潜力，发现HPV E6/E7 mRNA具有显著区分正常和宫颈病变的潜力，其AUC达0.8778(95% CI 0.7932-0.9624,P<0.0001)。见图2。

图2 HPV E6/E7 mRNA的ROC曲线

进一步评估HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变诊断中的灵敏度和特异度，HPV E6/E7 mRNA检测诊断高级别宫颈病变的灵敏度为81.82%(95% CI 67.29%-91.81%)，特异度为81.25%(95% CI 54.35%-95.95%)，阳性预测值为92.31%(95% CI 79.13%-98.38%)，阴性预测值为61.90%(95% CI 38.44%-81.89%)。见表2、表3。

表2 HPV E6/E7 mRNA检测与病理检查结果

表3 HPV E6/E7 mRNA 检测对宫颈病变的诊断价值(%)

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，大量的流行病学调查和研究表明HPV的持续性感染是宫颈癌发生的首要原因[13]。HPV16和HPV18是最具侵略性的病毒类型[14]，全球绝大部分的宫颈癌的发生与其有关，它们通过持续感染并整合到宿主基因组中，一方面导致各种肿瘤抑制因子的沉默，另一方面诱导各种肿瘤促进因子的激活，最终导致宫颈癌的发生[2]。HPV 基因组的癌基因E6和E7是正常宫颈上皮中肿瘤发生的主要驱动器，它们通过将其DNA整合到宿主染色体脆弱区，使E6和E7蛋白过量表达，这两种蛋白通过抑制p53、Rb等抑癌基因的功能参与Notch1、Wnt、MAPK、mTOR以及 STAT等相关通路的调控，从而影响细胞的生长、分化及免疫功能，最终导致细胞生长失控并永生化为癌细胞[3,15-18]。由于细胞学形态变化是HPV感染宫颈上皮细胞后引起的，因此细胞学检查在早期筛查中存在一定的弊端，且常受实验操作和取材的影响。HPV的早期筛查联合细胞学检查能有效的避免单项检查的不足，提高早期筛查的效率。

本研究利用流式细胞术定量检测了对照样本和不同程度的宫颈病变样本中HPV E6/E7 mRNA的表达情况以评估HPV E6/E7 mRNA作为早期筛查指标的诊断效能。结果发现CIN Ⅱ组(72.7%)、CIN Ⅲ组(80%)和宫颈癌组(88.9%)的HPV E6/E7 mRNA阳性率显著高于正常对照组(18.8%)，差异具有统计学意义，表明HPV E6/E7 mRNA 作为筛查指标的可行性，但在我们的研究中宫颈病变各组之间HPV E6/E7 mRNA的表达水平没有显著差异，这也与其他学者的报道较一致[19]。根据宫颈病变中HPV E6/E7 mRNA的表达量进行ROC曲线分析，结果显示ROC曲线下的相关区域面积AUC达0.8778(95% CI 0.7932-0.9624)，差异具有统计学意义，这表明了HPV E6/E7 mRNA作为宫颈癌筛查指标的重要价值，同时我们进一步对比了其他研究的报道，我们发现流式细胞术检测的HPV E6/E7 mRNA的诊断效能显著高于HPV DNA的检测，这与其他学者的报道一致[20-21]，且优于其他方法对HPV E6/E7 mRNA的检测[19]。因为CINⅡ-Ⅲ 属于高级别的宫颈上皮内病变，常常需要有创操作进行干预，因此在该研究中我们对CINⅡ级及以上的病变进行深入的分析。本研究发现CINⅡ+ HPV E6/E7 mRNA的灵敏度为81.82%，特异度为81.25%，阳性预测值为92.31%，此结果与学者Kottaridi的研究较一致[12]，可见HPV E6/E7 mRNA可以准确地筛选出宫颈病变高危人群并监测疾病的发展。但该研究中阴性预测值仅为61.90%，其准确性欠佳，因此HPV E6/E7 mRNA作为宫颈癌早期筛查还需要与细胞学检查等手段联合分析才能避免漏诊，从而更好的为临床服务。

目前，市面上常见的检测核酸产品技术主要包括荧光定量PCR技术、核酸原位杂交技术、基因测序技术等。由于这些技术尚存在难以自动化、分析过程复杂、价格昂贵等特点因此较难普及。本技术的试验操作基本上同传统的流式细胞术相同，处理96样本的全程操作到获得检测数据仅需2小时时间，节省了至少一倍的时间，全程不需核酸提取和扩增反应;在细胞内直接进行分子信标杂交后上机进行检测，具有稳定性高、特异性强、灵敏度高、更快速和结果客观的技术优势;仪器及试剂价格与荧光PCR比较类似，相信具有较为广阔的应用前景。