有机磷农药降解酶opdA的提取和酶学性质

□ 郑佩华 苏胜艳

（1.华南农业大学，广东 广州 510650；2.瑞辰星生物技术（广州）有限公司，广东 广州 510650）

有机磷农药是目前我国使用最广泛的杀虫剂，长期大量的使用对生态环境和人类健康产生的负面影响越来越严重，尤其是在农产品中产生的农药残留引起人们的广泛关注［1，2］。有机磷农药降解酶通过破坏分子中的磷酯键使农药失去或降低毒性［3］。通常一种有机磷农药降解酶可同时对多种有机磷农药起降解作用。生物降解法在农残降解领域具有极大的潜力［4］。本文选择工程菌株实现有机磷农药降解酶opdA在大肠杆菌中的高效表达，通过高压均质破碎和高速离心分离胞内酶opdA，分析opdA的酶学性质，研究结果为opdA的后续应用奠定了基础。

一、材料和方法

（一）菌种和质粒

E.coliBL21（DE3）/pET-28a-opdA为本实验室构建及保存。

（二）培养基和仪器

LB培养基：称取氯化钠10g、蛋白胨10g、葡萄糖1g、酵母提取物5g，溶解至1L蒸馏水中；再加入琼脂15g/L即为固体培养基。

发酵培养基：磷酸二氢钾72g/L，一水柠檬酸2.0g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，七水硫酸镁5.0g/L，甘油3.6g/L，浓硫酸0.02%，微量金属溶液0.2%，pH调节到4.5～5.0。

UV-1900i分光光度计，日本岛津；LYNX6000落地式离心机，ThermoScientific；C1000PCR仪，伯乐生命；SCIENTZ-ⅡD超声波破碎仪，宁波生物。

（三）培养方法

将实验室保藏的冷冻菌体取出解冻后，接入装有LB液体培养基的250mL三角摇瓶，恒温培养过夜复活菌体，取复活菌体稀释涂布到LB固体培养基上，培养至长出单菌落后，挑一环接入LB斜面上，37℃培养至长出菌落，这就是E.coli斜面，在生物安全柜的无菌环境中，挑一环接入LB培养基中，恒温培养至菌体OD600为1.0～2.0，这就是种子液。

将准备好的发酵培养基加入到发酵罐中，种子液按2%的量接入，设定发酵参数进行发酵培养。监测相关参数。待菌量进入对数生长期时，以终浓度为1.0mmol/L的量加入诱导剂IPTG，间隔1小时取样进行超声破碎，检测酶活及菌量，在28℃条件下诱导表达至菌量稳定，酶活最高时，结束发酵。

（四）有机磷农药降解酶opdA的提取

按上述培养方法收集的菌体，加入匀质缓冲液（60mL/L）和曲拉通TritonX-100（7mL/L），在4℃条件下进行高压均质破碎，完成破碎后加入终浓度为3mmol/L氯化锌溶液以稳定酶的结构，破碎后的液料进一步进行离心分离，得到胞内酶opdA，此为粗酶液。

（五）主要试剂

甲基对硫磷纯品（北京中科质检）；蛋白质Marker（Fermantas）；TEMED标准蛋白及其他相关试剂均购自上海麦克林生化科技公司。

（六）蛋白质浓度测定

采用Bradford法［5］，配置系列浓度为0、10、20、40、60、80、100（单位：μg/mL）的牛血清蛋白溶液，加入考马斯亮蓝G-250，测定波长595nm位置处的吸光值，得到回归方程y=0.0073x+0.0983，相关系数R2=0.9941，样品蛋白含量通过标准曲线计算。

（七）SDS-PAGE电泳［6］

制备分离胶和浓缩胶，移取经过适当稀释的粗酶液样品和蛋白Marker加入到不同样品槽中，将电泳槽放置到电泳仪上进行电泳。待电泳结束，用R250染色液对电泳凝胶进行染色，然后脱色至背景颜色为透明。估算出有机磷降解酶蛋白的分子量大小。

（八）酶活力的测定方法

1.酶活力测定步骤

准确吸取960μL测试缓冲液于1.5mL离心管中，加入含有20μL浓度为3mmol/L甲基对硫磷-甲醇底物溶液，加入20μL经过适当稀释的粗酶液，用分光光度计测定在400nm位置处0～5min的吸光度。计算水解产物PNP的含量和opdA酶活［7］。酶活单位定义：室温下每分钟水解底物产生1μmolPNP所需要的酶量。

2.标准曲线的绘制

用测试缓冲溶配制浓度为0、5、10、20、40、60、80、100（单位：μmol/L）的硝基苯酚标准系列溶液，在400nm位置比色测得对应的吸光值。得到回归方程为y=0.017x+0.0085，相关系数R2=0.9998。

二、结果和讨论

（一）酶的分离纯化

1.硫酸铵的分级沉淀

在冰水浴中向粗酶液中加入占溶液总量的百分比为30%的硫酸铵固体，在0～4℃环境中平衡过夜后，转移至离心管，超高速冷冻离心后，取出下层沉淀物，溶于少量0.05mmol/LTris-HCl缓冲液中，进一步透析后用聚乙二醇将酶液浓缩，装瓶冷藏于4℃冰箱种备用。

2.纯化结果（见表1）

表1 有机磷农药降解酶opdA的分离纯化

（二）酶学性质研究

后续测定所使用的酶液为高压均质破碎、高速离心后的粗酶液，测定中的底物均为3mmol/L甲基对硫磷，每个测定条件设置3个平行试验。

1.酶的纯度及分子量

将上述粗酶液分别稀释10倍、100倍、1000倍，取样进行凝胶电泳，结果如图1所示。当样品稀释10倍，100倍时，目的蛋白条带明显，大小约为35KDa，稀释1000倍的条带较淡看不清楚，可得知有机磷农药降解酶opdA的分子大小为35KDa。

图1 重组opdA诱导表达的SDS-PAGE分析

2.酶的最适温度及其稳定性

在pH8.0，不同温度条件下测定酶活，opdA的最适反应温度见图2（a），随着温度的上升，opdA酶活先上升后下降。35℃为opdA酶的最适反应温度。将粗酶液在25～65℃条件下保存4h，期间每隔30min测定1次酶活力，以该酶在各温度的初始酶活为100%，计算相对酶活。有机磷农药降解酶opdA在25～40℃酶活稳定，见图2（b），4h后酶活力仍保持在79%以上。45℃表现出较好的稳定性，保温4h酶活力后仍有48%。但温度高于45℃后，有机磷农药降解酶opdA的稳定性较差，4h后基本都失去了酶活。

图2 反应温度对opdA的活力及稳定性的影响

3.酶的最适pH及其稳定性

在25℃、不同pH（4～10）的缓冲溶液中进行反应，测定粗酶液的酶活，如图3（a），当pH在5.0～9.0时，酶活随着pH的升高逐渐升高，最适pH为9.0；pH高于9.0后，酶活下降，但在pH为10.0时还保持80%左右的酶活力。将粗酶液保存在不同pH（4，5，6，7，8，9，10）缓冲液中，在室温（25℃）下放置4h，期间每隔0.5h测定1次酶活，以该酶在各pH的初始酶活为100%，计算该酶各时间段所对应的相对酶活。如图3（b）所示，有机磷农药降解酶opdA在pH6～10都具有较好的稳定性，4h后仍能保持90%以上的酶活，当pH值为4～5时，酶活力快速下降。

图3 反应pH对opdA的活力及稳定性影响4.金属离子对酶活的影响

配置浓度不同金属离子溶液，使稀释后的待测粗酶液中金属离子的终浓度为10mmol/L，室温（25℃）保存30min，测定酶活。以去离子水稀释的酶液作为空白对照，结果如图4所示。Mg2+、Mn2+对opdA有一定促进的作用，Fe2+、Al3+对opdA表现较强的抑制作用，K+、Na+等其他金属离子对opdA活性影响不显著。

图4 不同金属离子对opdA酶活力的影响

5.有机磷农药降解酶opdA广谱性测试

选用甲基对硫磷、敌百虫、敌敌畏、辛硫磷、毒死蜱等5种农药，利用胆碱酯酶抑制率法进行有机磷农药降解酶opdA对不同有机磷农药残留降解效果的研究，在测试缓冲溶液中加入一定量的农药标准液，测试组分别加入50ppm有机磷农药降解酶opdA，对照组加入等量去离子水，静置10min后取样检测农残，具体结果如图5所示。加入有机磷农药降解酶opdA进行酶处理的所有组别中，胆碱酯酶抑制率均低于50%，为农残阴性；而对照组的胆碱酯酶抑制率均在93%以上，为阳性。实验结果表明，有机磷农药降解酶opdA对本次实验所选的5种不同的有机磷农药均有不同程度的降解能力，仅经过10min时间处理即可使农药降解，测试结果由阳转阴，降解酶opdA的广谱性佳。进一步研究该酶的应用，对消除环境或者农产品中的农药污染具有广泛的应用前景。

图5 有机磷农药降解酶opdA对不同有机磷农药降解效果图