细胞色素CYP17a1 基因在锦鲤性腺不同发育时期的表达分析

史东杰，谭 政，，张 强，伍仕弘，魏 东，李文通，王赛赛，孙砚胜，姜巨峰

（1. 北京市农林科学院 水产科学研究所，北京 100068；2. 农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 100097；3. 天津农学院 水产学院，天津 300380；4. 北京市通州区动物疫病预防控制中心，北京 101101；5. 北京雅仕锦鲤养殖技术有限公司，北京 102615；6. 天津市水产研究所暨天津市观赏鱼技术工程中心，天津 300221）

鱼类早期性别决定与分化是一个可调控的发育过程，水温、光照、酸碱度、养殖密度和外源激素等因素均能产生重要的影响[1]。细胞色素CYP17 或P450c17 作为性腺类固醇激素、孕激素及糖皮质激素生物合成的关键限速酶，其活性和表达在调控性腺发育、生殖细胞分化及第二性征维持等方面起到重要的作用[2‑4]。在硬骨鱼类中，细胞色素CYP17 至少 有2 种 复 制 基 因，即CYP17a1和CYP17a2[5‑6]。CYP17a1多在性腺表达，同时具有羟化酶和裂解酶的活性，而CYP17a2多在性腺和头肾中表达，且仅有羟化酶活性[5‑8]。目前，CYP17a1已在人类、哺乳动物和鱼类等多个物种被成功克隆[9‑15]。有研究发现，CYP17a1在金钱鱼（Scatophagus argus）的卵巢和精巢中表达量较高，且在Ⅳ期卵巢的表达量最高，说明CYP17a1在金钱鱼性腺发育过程中具有重要的调控作用[14]。ZHOU 等[5]研究表明，CYP17a1对青鳉（Oryzias latipes）卵巢的卵母细胞分化过程中雌二醇的形成具有重要的作用。ZHAI 等[16]敲除斑马鱼（Danio rerio）CYP17a1基因后，雌性突变鱼出现转雄的现象，雄性突变鱼的交配行为和第二性征缺失。此外，CYP17a1基因也与黄鳝（Monopterus albus）[17]、虹 鳟（Oncorhynchus mykiss）[18]、半 滑 舌 鳎（Cynoglossus semilaevis）[19]的性腺发育密切相关。以上研究表明，CYP17a1在鱼类精巢、卵巢发育，配子发生和性别决定等方面具有非常重要的调节作用。

锦 鲤 隶 属 鲤 形 目（Cypriniformes）、鲤 科（Cyprinidae）、鲤属（Cyprinus），其体型健美，色彩艳丽，斑纹变幻莫测，极具观赏价值[19]。该鱼不仅是我国名贵淡水观赏鱼类的代表品种，也是研究鱼类体色遗传机制的模式动物。目前，有关锦鲤的研究多集中于人工选育、自然繁殖及营养饲料等方面，而关于锦鲤生殖调控的研究鲜有报道。鉴于此，研究细胞色素CYP17a1基因在锦鲤雌雄性腺不同发育时期的表达规律，旨在为解析观赏鱼类生殖调控机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试鱼 1 龄、2 龄和3 龄锦鲤取自北京市观赏鱼创新团队大兴综合试验站，雌鱼、雄鱼各龄分别为36 尾，水温通过温控管控制在20～22 ℃，日常投喂正规厂家商品饲料，上下午定时各1次，日投喂量为鱼体质量的3%～5%，曝气管充氧，自然光照。

1.1.2 主 要 试 剂 SYBR Premix ExTaqTMⅡKit、Passive Reference Dye Ⅱ、pMD19-T 和PrimeScript RT 试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；MMLV 购自Promega 公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、MS-222 购 自Sigma 公 司；Trizol 试 剂 购 自Invitrogen 公司；DNA Marker 购自天根生物公司；考马斯亮蓝CBBG-250、牛血清白蛋白（BSA）、Cocktail蛋白酶、Western blot 聚丙烯酰胺凝胶和CYP17a1、β-actin抗体等均购自北京兆仪世纪科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据SYBR Premix ExTaqTMⅡKit的引物设计原则，用Primer Premier 5.0软件设计细胞色素CYP17a1基因和β-actin基因的特异引物。β-actin基因为内参基因。引物委托宝生物工程（大连）有限公司合成。引物序列信息见表1。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.2.2 试验样品 待供试鱼养殖20 d 后，分别取1龄、2 龄和3 龄锦鲤卵巢、精巢、脑、肌肉、肾脏共5种组织，卵巢和精巢按照硬骨鱼类性腺发育Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期共6 个时期[20]取样，每组3次重复。测量各龄锦鲤体质量（Body weight，BW）、性腺质量（Gonad weight，GW）、内脏质量（Visceral weight，GW），计算性腺成熟系数（GSI），GSI=GW/（BW-VW）×100%。卵巢、精巢组织用液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.3 总RNA 的提取与cDNA 第一条链合成 采用Trizol 法提取1 龄、2 龄和3 龄锦鲤卵巢和精巢总RNA，用琼脂糖凝胶电泳确定RNA 完整性，要求OD260/OD280值为1.8～2.0[21]。将符合上述要求的样本RNA 参照PrimeScript RT 试剂盒的使用说明书，分别将用于CYP17a1基因在锦鲤3 个年龄、6 个不同性腺发育时期表达研究的54 个样本各1 μg RNA 进行cDNA 第一条链的合成，并进行适量稀释。保存在-80 ℃冰箱。

1.2.4 引物特异性验证 溶解曲线由实时荧光定量 PCR 仪（ABI 7500HT platform， Applied Biosystems）自动生成。溶解曲线仅有1 个峰值说明其是特异性产物扩增获得，以此来鉴定RT-PCR 试验中所用引物的特异性。1.2.5 实时荧光定量PCR 检测 将锦鲤β-actin基因和CYP17a1基因cDNA 原液按照51、52、53、54倍进行稀释，每组设3个平行，阴性对照为蒸馏水。实时荧光定量PCR 反应体系：共20 μL，其中2×SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL，上下游引物（10 μmol/L）分别 为 0.6 μL，cDNA 模 板 1.0 μL，50×Passive Reference Dye Ⅱ0.4 μL，蒸馏水7.4 μL。反应条件：95 ℃变性5 s；58 ℃退火40 s，95 ℃延伸15 s，40个循环。每个样品均重复3 次。绘制β-actin基因和CYP17a1基因标准曲线。

1.2.6 Western blot 分析 取出封存于-80 ℃冰箱的不同发育时期性腺样品，解冻研磨成粉状，加入含有Cocktail 蛋白酶制剂的蛋白质抽提液，冰上裂解20 min，然后在4 ℃条件下15 000 r/min 离心20 min，取上清液，采用Bradford 考马斯亮蓝法[22]测定总蛋白质浓度。参照邹立军等[23]对斑马鱼JNKs蛋白Western blot 方法步骤操作。将硝酸纤维素膜的显影结果采用Sigmaplot 和Glpro32 软件计算CYP17a1/β-actin灰度比值。

1.3 数据分析

基因相对表达量采用2-△△Ct法计算[24]。数据用SPSS 20.0 软件进行单因子方差和多重比较分析，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 锦鲤性腺不同发育时期GSI的变化

从表2 可以看出，1～3 龄锦鲤雌鱼、雄鱼性腺发育不同时期GSI 变化规律基本相同，但卵巢GSI 均明显高于精巢。GSI 在3 龄锦鲤卵巢发育至Ⅴ期时最高，达到28.64%；随后卵巢进入Ⅵ期，即刚产完卵的卵巢，GSI 显著降低（P<0.05），但卵巢成熟前的Ⅰ—Ⅳ期的GSI 值显著增加（P<0.05）。1～3 龄锦鲤精巢GSI 明显低于卵巢，虽然在精巢Ⅴ期时出现峰值，但仅为9.57%；随着繁殖结束，精巢进入退化吸收阶段，此时精巢处于Ⅵ期，为退化期，GSI 显著降低（P<0.05），直至翌年精巢发育期Ⅰ—Ⅳ期有所升高，但与Ⅵ期相比，无显著性差异（P>0.05）。

表2 1龄、2龄和3龄锦鲤GSI的变化Tab.2 Profiles of GSI in one-year-old，two-year-old，and three-year-old Cyprinus carpio %

2.2 实时荧光定量PCR引物特异性验证及扩增效率鉴定

通过实时荧光定量PCR 检测显示，β-actin基因和CYP17a1基因分别在88.35 ℃和85.47 ℃时具有特异性单一峰，且整条曲线无杂峰，说明β-actin基因和CYP17a1基因特异产物单一，未产生引物二聚体，可满足后续试验要求。从图1可以看出，标准曲线结果显示，β-actin基因和CYP17a1基因引物扩增效率分别为94.873%和102.798%，Ct值标准偏差区间为0.02～0.15，线性程度在98%以上，表明试验所用引物可用于实时荧光定量PCR 反应，也可用2-△△Ct方法进行基因表达量分析。

图1 锦鲤β-actin 基因（A）和CYP17a1基因（B）的标准曲线Fig.1 Standard curves for the β-actin gene（A）and CYP17a1 gene（B）of Cyprinus carpio

2.3 CYP17a1基因在锦鲤不同组织的表达

由表3 可知，CYP17a1基因在1～3 龄锦鲤卵巢、精巢、脑、肌肉、肾脏等5种组织中都有表达，表现为精巢>卵巢>肌肉>肾脏>脑。各组织中CYP17a1基因的表达量差异显著，在精巢中表达量最高，在脑组织表达量最低。CYP17a1基因在3龄锦鲤的精巢和卵巢中的表达量分别是脑组织的40.30 倍和42.87 倍，且其在精巢中的表达量是卵巢的1.80 倍。CYP17a1基因在锦鲤卵巢、精巢的表达量随着年龄的增加有升高趋势，但是在脑、肌肉和肾脏中无明显差别。

表3 CYP17a1基因在1龄、2龄和3龄锦鲤5种组织的相对表达量Tab.3 Relative expression of CYP17a1 gene in five tissues of one-year-old，two-year-old，and three-year-old Cyprinus carpio

2.4 CYP17a1基因在锦鲤不同性腺发育时期的表达

如图2所示，CYP17a1在1龄、2龄和3龄锦鲤卵巢组织Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期6个不同发育时期表达量均呈先降低后升高趋势，性成熟前期（Ⅰ期、Ⅱ期）显著高于性成熟后期（Ⅵ期），性成熟后期（Ⅵ期）显著高于性成熟期（Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期），CYP17a1基因在精巢的表达量与卵巢呈现相同的趋势。

图2 CYP17a1基因在1龄（A）、2龄（B）和3龄（C）锦鲤6个性腺发育时期的相对表达量Fig.2 Relative expression level of CYP17a1 gene in six different developmental periods of gonads in Cyprinus carpio of the one-year-old（A），two-year-old（B），and three-year-old（C）instar

CYP17a1基因在不同年龄锦鲤卵巢组织的表达结果显示，3龄锦鲤卵巢Ⅰ期表达量最高，是同龄锦鲤卵巢Ⅲ期和Ⅳ期表达量的2.31 倍和2.57 倍。CYP17a1基因在不同年龄锦鲤精巢组织的表达结果显示，3龄锦鲤精巢Ⅰ期表达量最高，是同龄锦鲤精巢Ⅲ期和Ⅳ期表达量的2.75倍和3.13倍。

整体上，随着年龄增长，锦鲤CYP17a1基因各发育时期表达量均呈现升高趋势。3 龄时，各发育时期CYP17a1基因表达量较高；在3 龄锦鲤精巢Ⅰ期表达量最高，为同期卵巢的1.82倍。

2.5 CYP17a1蛋白在锦鲤不同性腺发育时期的表达

如图3 所示，CYP17a1 蛋白在1～3 龄锦鲤精巢发育不同时期呈现出明显波动，其表达趋势与基因mRNA 表达模式一致，即精巢性成熟Ⅰ期、Ⅱ期表达量最高，到达精巢成熟期Ⅲ～Ⅴ期显著降低，随着精巢进入性成熟Ⅵ期，CYP17a1 蛋白的表达量逐渐升高。

图3 CYP17a1 蛋白在1龄（A）、2龄（B）和3龄（C）锦鲤6个性腺发育时期的相对表达丰度Fig.3 The relative expression of CYP17a1 protein in six different developmental periods of gonads in Cyprinus carpio of the one-year-old（A），two-year-old（B），and three-year-old（C）instar

CYP17a1 蛋白在1 龄、2 龄和3 龄锦鲤卵巢发育不同时期的表达量均较同龄同期精巢低，其中1 龄卵巢Ⅲ期表达水平最低。

3 结论与讨论

细胞色素CYP 是一类辅基为亚铁血硫素蛋白酶基因家族，CYP17a 属于CYP 的超级家族。CYP17a 在鱼类性腺发育中起到重要作用[2‑4]。前人研究认为，硬骨鱼类有2 个细胞色素CYP17a 基因，即CYP17a1和CYP17a2，且鱼类CYP17a1基因活性与哺乳动物相一致[5‑8]。CYP17a 是性腺合成与代谢中的关键酶，其遗传的多态性能改变裂解酶和催化酶的活性。CYP活性部位含有400～500个血红素基团和氨基酸残基，血红素的第5 个配位键可将带正电的铁离子和带负电的硫原子连接，从而完成CYP复杂的修饰调节功能[7‑8]。

随着人类和哺乳动物CYP17a 基因的广泛研究[9‑13]，关于其在鱼类中的表达试验也在同步开展。陈孝红等[21]采用RT-PCR 技术检测到CYP17a1基因在斑马鱼性成熟个体的卵巢、精巢、肌肉和脑等组织中均有表达，且精巢的表达量远高于卵巢。翟毅等[14]利用转录组测序和RT-PCR 技术在金钱鱼的精巢、卵巢、肝、脑和头肾中，均检测到CYP17a1基因的表达，而在心脏、肌肉、脾脏、肠和鳃中均未检测到。本研究结果表明，CYP17a1基因在锦鲤卵巢、精巢、脑、肌肉和肾脏都有表达，且在精巢和卵巢中具有较高的表达水平。此外，与黄鳝[17]、绿鳍马面鲀[15]和斑马鱼[25]脑组织中的表达相似，在锦鲤的脑组织中同样检测到CYP17a1基因的表达。推测CYP17a1基因可能参与鱼类脑组织中类固醇激素的合成与分泌。

对黄鳝[17]、斑马鱼[16]、虹鳟[18]、金钱鱼[14]和青鳉[6]等硬骨鱼类研究发现，CYP17a 在性腺发育中扮演着重要的角色。杨兰英等[26]研究发现，利用CRISPRI Cas9 技术敲除尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）细胞色素CYP17a 基因后，与对照组相比，敲除组雌鱼无法正常产卵，且血清孕激素17a，20β双羟孕酮和皮质醇合成水平均显著降低，敲除组雄鱼精子发生延迟，且向前运动的精子比例降低，不运动的精子比例明显升高。斑马鱼CYP17a1基因缺失后会出现性逆转，雄鱼精子量增加、雄性交配障碍和第2 性征缺失等现象[16]。将青鳉CYP17a1基因敲除后，雌、雄鱼第二性征均出现丢失现象，雌鱼卵巢呈现精巢形态，有大量精子存在，但无法正常配对[27]。

本研究中，CYP17a1基因在锦鲤6 个性腺发育时期的表达量变化较大，呈现出先降低后升高的趋势，且在性成熟前期（Ⅰ期、Ⅱ期）的表达量显著高于其他各期。SU 等[28]研究发现，在日本鳗鱼（Anguilla japonica）的卵黄囊形成过程中，CYP17a1基因的高表达抑制了17α-羟基孕酮向MIH 17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮的转化，这也进一步解析了人工养殖的日本鳗鱼雌性性成熟率不高的原因。本研究中，CYP17a1基因在锦鲤精巢的表达量高于卵巢，进一步说明，在锦鲤和其他硬骨鱼类中，CYP17a1对精巢发育的调控作用要大于卵巢。此外，锦鲤性腺中CYP17a1基因的表达规律与金钱鱼[14]CYP17a1基因和半滑舌鳎[29]P450c17-Ⅱ的表达规律相同，而与虹鳟[19]和绿鳍马面鲀[15]的研究结果不同，虹鳟的卵巢发育前期未检测到CYP17a1基因，而绿鳍马面鲀的卵巢CYP17a1基因的表达量峰值出现在成熟期，推测原因可能与鱼类种质差异及其在不同物种的调控作用不同有关。可见，CYP17a1对鱼类性腺的调控机制还有待进一步深入研究。

综上，CYP17a1在mRNA 水平的表达结果显示，其在精巢的表达量远高于卵巢。Western blot 检测结果显示，CYP17a1 蛋白的表达水平与mRNA 一致，暗示CYP17a1基因在锦鲤精巢发育及精子细胞分化成熟中发挥一定的调控作用。