微管纸喷雾质谱法快速筛查血液中5种强极性毒物

张云峰，董林沛，赵 森，孙 龙，常 靖，任昕昕，王爱华

（1.公安部物证鉴定中心，北京 100038；2.浙江警察学院，浙江 杭州 310053；3.北京清谱科技有限公司，北京 100084）

强极性农药（如百草枯、草甘膦等农药）由于性能高效、价格低廉，曾在全球范围内广泛使用，其引发的投毒、误服、自杀等中毒（案）事件时有发生［1］。强极性农药特别是百草枯等对人和动物具有极高的毒性，会对人体造成不可逆的严重损害，目前尚无特效解毒剂，中毒致死率非常高［2－3］。目前大部分强极性农药和类似的致毒强极性物质已被国家管控或停止销售，但仍有不法分子违规生产和销售禁用物质，导致社会上频繁出现百草枯、草甘膦等强极性物质中毒事件［3－4］，强极性药物如氯化琥珀胆碱则时常在致死案件中出现［5－6］。及时发现中毒物质可为中毒者救治方案的制定提供帮助，这对检验中毒人员体内毒物的仪器和方法提出了很高的时效性要求。

目前检测百草枯、敌草快、草甘膦、草铵膦、氯化琥珀胆碱几种强极性物质的主要方法为液相色谱法（LC）和气相色谱法（GC）［7－12］。由于这几种物质极易溶于水，挥发性差，分子量小，且在气相会形成不同极性的离子，故同时检测的难度相比于其他物质有所增加［13］。色谱法需配合复杂的前处理，且分离时间较长，影响中毒人员的即时诊断与救治［14－16］。针对中毒人员体内毒物的分析，需要更加快速的检测手段，同时要保证准确性，避免错误结果所带来的误诊和错误治疗［17］。

自2004年Cooks等开发出能够原位电离的解吸附电喷雾电离源（DESI）以来［18］，原位电离技术取得了快速发展，各种原位电离技术被开发出来并应用于不同领域［19－21］。原位电离方法是指无需样品前处理，直接对样品进行质谱检测的方法［22］，极大提高了检测的便捷性和时效性。纸喷雾技术作为原位电离的一个热门方向，因成本低廉、操作简单、分析时间短，在医药、食品、环境等领域被广泛研究和应用［23－25］。但是在制作纸喷雾的纸基时，纸基尖端很容易被损毁，进而影响喷雾的稳定性。微管纸喷雾（PCS）技术将微管和纸基结合，在电场作用下溶剂溶解分析物后从纸基流经微管形成喷雾，极大提高了喷雾稳定性，解决了纸喷雾生产和使用中的技术问题，显著提高了纸喷雾性能［26］，成为较早实现商业化应用的纸喷雾技术之一［27］。

目前微管纸喷雾多用于一般极性物质的检测，如含吡唑的多种抗菌剂［28］和芬太尼［29］等毒品，很少有针对强极性目标物检测的应用案例。本文建立了微管纸喷雾技术串联四极杆质谱仪快速筛查血液中敌草快、百草枯、草甘膦、草铵膦和氯化琥珀胆碱5种强极性毒物的方法。该方法操作简便，快捷高效，可在1 min内得到结果，显著提高了检测的时效性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

8040三重四极杆质谱仪（日本岛津公司）；MS Mate质谱仪原位电离离子源、PCS原位电离试剂盒（北京清谱科技有限公司）。

百草枯标准品、草甘膦标准品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；敌草快标准品、氯化琥珀胆碱二水合物标准品（上海安谱科技有限公司）；草铵膦标准品（坛墨质检科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（LC－MS级，美国Thermo Fisher Scientific公司）；实验用水为二次蒸馏水；空白全血样品为兔血样品（4℃保存），实际样品由首都医科大学复兴医院提供。

1.2 标准溶液的配制

准确称取一定量标准品，用水配制成1 000 mg/L标准储备溶液，于4℃保存；使用甲醇逐级稀释标准溶液至适宜浓度，得到工作溶液，现用现配；配制全血样品时，根据实际浓度需要，向空白全血中加入一定量的工作溶液，现用现配。

1.3 质谱条件与上样条件

离子源：MS Mate质谱仪原位电离离子源（与PCS原位电离试剂盒搭配使用）；扫描模式：多反应监测（MRM）模式；质谱极性：正负模式同时扫描；喷雾电压：4.5 kV（正模式），－4.0 kV（负模式）；离子传输管温度：250℃；加热模块温度：250℃。

上样条件：取100μL血液样品，向其中加入9倍体积（900μL）的甲醇溶液，用手剧烈摇动5 s混匀，静置30 s，取100μL上清液至PCS检测盒后端，直接在质谱上检测。

1.4 方法学考察

1.4.1 质谱条件优化使用目标物的甲醇工作溶液，在正负模式下进行一级质谱图扫描，同时优化喷雾电压、离子传输管温度、加热模块温度等质谱前端条件，使MS全扫模式中目标物离子强度最优，从而确定质谱极性和质谱前端条件。然后根据目标物的性质，确定前体离子质荷比m/z，采集其串联质谱谱图（MS/MS）。调节碰撞能量，使目标化合物的产物离子信号最高，选择信号强度最高的两个离子作为产物离子，其中强度最高的为定量离子，强度次高的为定性离子。

1.4.2 PCS上样方式优化取质量浓度为5 mg/L的标准物质水溶液或血液加标样品，分别考察以下5种上样方式对检测信号的影响：（1）直接上样100μL样品；（2）点样10μL后烘干用100μL甲醇洗脱；（3）点样10μL后烘干用100μL乙腈洗脱；（4）水－甲醇（1∶9，体积比）提取后上样100μL；（5）水－乙腈（1∶9，体积比）提取后上样100μL。

1.4.3 检出限及线性测定按照“1.3”上样条件，制备空白血液基质提取液。加入标准溶液，使基质体积分数为95%，配制成不同浓度的基质标准溶液。测试不同浓度基质标准溶液中5种化合物的信号强度，绘制不同化合物的基质标准曲线。

取空白全血，加入标准溶液配制不同浓度的加标样品，标准溶液的体积分数不超过全血样品体积的5%。使用“1.3”上样条件，测定不同浓度下5种化合物的信号强度，以3倍信噪比对应的浓度为检出限。

1.4.4 回收率及稳定性测定取空白全血，加入标准溶液配制不同浓度的加标样品，标准溶液的体积分数不超过全血样品体积的5%。配制1倍检出限浓度，2倍检出限浓度和10倍检出限浓度共3个浓度水平的加标样品，每个浓度水平制备6个平行样品进行测试，计算方法的回收率和相对标准偏差（RSD）。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

为了达到最优检测效果，采用“1.4.1”方法，以不含基质的标准物质工作溶液对每种物质的质谱条件进行优化，包括质谱前端条件、极性、MRM检测离子对、碰撞能量等。优化后的质谱前端条件见“1.3”，各目标化合物的质谱条件见表1。

表1 5种极性毒物的化学式和质谱条件Table 1 Chemical information and MS parameters of the five polar poisons

2.2 上样方式优化

由于微管纸喷雾的上样方式（即不同的目标物提取方式）会对检测结果产生较大影响，因此本文对上样方式进行了优化。一般微管纸喷雾有3种主要的上样方式：直接上样法（图1A）、点样洗脱法（图1B）和提取上样法（图1C）。直接上样法是将液体样品直接上样（100μL）至微管纸喷雾检测盒并进行检测；点样洗脱法是在微管纸喷雾检测盒上先点样10μL，烘干，再加入100μL洗脱溶剂将目标物洗脱；提取上样法先对样品进行简单提取，再取提取液100μL上样至微管纸喷雾检测盒并进行检测。

图1 不同上样方式示意图Fig.1 Workflows of different injection methods

首先，使用标准物质的水溶液进行上样方式优化。结果表明，采用100μL直接上样方式时，很难检测到目标物信号，这可能是由于水的粘度大、沸点高，不易挥发，形成喷雾液滴后溶剂难去除，无法生成离子［30］。使用点样10μL烘干后溶剂洗脱的方式上样时，无论选择甲醇还是乙腈作为洗脱溶剂，得到的草铵膦和草甘膦信号都很低。使用乙腈提取后直接上样，虽然敌草快、百草枯和氯化琥珀胆碱的信号较好，但是草铵膦的信号非常低。而使用甲醇提取后上样，能兼顾所有目标物的信号强度。因此，对标准物质的水溶液而言，使用甲醇提取可获得最好的检测效果。使用全血样品时，“1.4.2”中的5种上样方式获得了类似的结果，即使用甲醇提取可获得最好的测试结果。

以甲醇为提取液，使用标准物质的水溶液优化不同提取比例（样品∶提取液，1∶1、1∶4、1∶9）下各化合物的信号响应，每个提取比例检测3次，取其平均值。结果显示，敌草快、百草枯和氯化琥珀胆碱在提取比例1∶1时可以得到较高的信号，随着提取比例的增加，信号降低；草甘膦在1∶4时得到最高信号，草铵膦在1∶9时得到最高信号。为兼顾所有化合物，使用提取比例1∶9对样品进行提取。并使用全血样品验证优化结果，确定血液基质中样品和提取液比例为1∶9时所有化合物均可得到较好的信号强度。

综上所述，考虑到所有目标物的信号差异，最终选择使用样品∶甲醇为1∶9进行提取，再取100μL提取液上样的方式进行检测。

2.3 检出限及线性范围

PCS已经在不同体系下验证了其可定量性［26，28］，本文评估了其对强极性物质的定量性能。使用本文所建立的方法，以基质标准溶液质量浓度为横坐标，目标化合物离子质谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，5种化合物的基质标准曲线在相应质量浓度范围内的相关系数均大于0.985。对不同质量浓度的血液加标样品进行检测，以3倍信噪比对应的质量浓度为检出限（LOD），全血中5种毒物快速筛查方法的检出限分别为敌草快0.05 mg/L、百草枯0.5 mg/L、草甘膦25 mg/L、草铵膦25 mg/L、氯化琥珀胆碱0.05 mg/L。5种化合物的线性范围、相关系数与检出限见表2，其中线性范围为实际上机浓度。空白全血与检出限浓度下加标全血样品的质谱图见图2。

图2 空白（左）与加标全血样品（右）的MRM质谱图Fig.2 The MRM mass spectra of blank（left）and spiked whole blood（right）

表2 5种化合物的线性范围、线性方程、相关系数与检出限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r2）and LODs for the 5 compounds

在急性中毒事件中，中毒人员血液中的毒物含量通常较高［3，8，31］，本方法的检出限能够满足急性中毒者血液中毒物的检测要求。整个检测过程可在1 min之内完成，极大提高了检测的时效性。

2.4 加标回收率与相对标准偏差

在常规质谱分析中使用内标可以提高方法的稳定性和回收率，但是内标价格昂贵，且使用内标操作繁琐，不适用于毒物的快速筛查，因此本文使用外标法评估方法的加标回收率与稳定性。对样品进行1倍、2倍和10倍检出限浓度的加标回收实验，每个浓度设置6个平行样品，得到回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表3。结果表明，本方法的回收率为62%～117%，RSD不大于40%，在未使用内标的情况下，依然可以满足快速筛查的需求。

表3 5种农药在3个加标水平下的回收率与相对标准偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of the 5 pesticides at 3 spiked levels（n=6）

2.5 实际样品测定

采用本方法对百草枯、敌草快中毒病人的全血样品进行检测。其中百草枯中毒者全血样品中百草枯含量为6.14 mg/L，RSD为17%；敌草快中毒者全血样品中敌草快含量为5.48 mg/L，RSD为9.3%；2份样本中无其他物质检出。本方法可以快速、准确地进行强极性毒物的快速筛查。

3 结 论

本文建立了PCS－Mate－MS/MS同时检测水基溶液和全血样品中敌草快、百草枯、草甘膦、草铵膦和氯化琥珀胆碱5种毒物的方法。该方法简单、快速、高效，与常规检测方法相比，样品处理大大简化，可在1 min内获得结果，分析时间极大缩短，能够用于血液样品的快速筛查，显著提高了检测时效性，具有广泛的应用前景。