不同浓度薏苡仁提取物对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制

樊 玲，赵景杰

口腔鳞状细胞癌(OSCC)约占全部口腔癌的90%，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，因局部侵袭性和颈部淋巴结转移率较高，OSCC的5年生存率仅为60%[1]。最差浸润方式代表肿瘤侵袭性，已成为影响OSCC预后的重要组织病理学因素，最差浸润方式分级越高患者复发率越高，术后生存时间越短[2]。HE等[3]研究指出，肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的关键因素之一为血小板源性生长因子及其受体间的相互作用。血小板源性生长因子B(PDGFB)与血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)相互作用，诱导PDGFRβ磷酸化并激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，而细胞增殖、存活和血管生成等多种生理活动都离不开PI3K信号传导通路，提示该通路可能是潜在的抗肿瘤治疗靶点[4-5]。薏苡仁为禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁，味甘淡，性微寒，薏苡仁提取物已证明在抗氧化、增强免疫、抗肿瘤等多方面有良好的作用，但目前薏苡仁提取物对OSCC的抗肿瘤作用相关研究较少[6]。故本研究通过观察不同作用浓度薏苡仁提取物对人OSCC CAL27细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其潜在作用机制，旨在为OSCC治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 薏苡仁提取物(西安金绿生物工程技术有限公司，批号：1312046-3)；RPMI-1640培养基、10%胎牛血清(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：HB-FBS-1B、HB-FBS-500)；结晶紫染液、聚偏氟乙烯膜、细胞蛋白抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号：P0033、C1027、SF4033)；PDGFB、PDGFRβ、磷酸化PDGFRβ(p-PDGFRβ)、PI3K、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)和β-actin抗体(美国Santa Cruz公司，批号：HZ-06458、HZ-064458、HZ-0684R2、HZ-0670R18、HZ-0611R18、HZ-4856R48和HZ-0742R1)；辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：115-58-264)。

1.2实验细胞培养及分组 人OSCC CAL27细胞购自中国典型培养物保藏中心，批号：CM-1250。37 ℃、5% CO2条件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，取对数生长期细胞进行实验，分为高剂量组、低剂量组、对照组。高、低剂量组分别予20、10 μmol/L薏苡仁提取物干预[6]，对照组不予任何干预。各项指标检测均设4个复孔。

1.3MTT法检测细胞增殖率 各组以每孔5×103个细胞浓度接种于96孔板，待细胞融合后按“1.2”项方法干预24 h后加入MTT(每孔20 μl)，37 ℃条件下继续培养4 h，酶标仪测定630 nm处吸光度(OD)值计算细胞增殖率，空白组为只添加培养基细胞，细胞增殖率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。

1.4细胞划痕法检测细胞迁移能力 各组以每孔5×104个细胞浓度接种于6孔板中，待细胞融合，于单层细胞上用灭菌枪头做“一”字划痕，无血清RPMI-1640培养基清洗3次，按“1.2”项方法干预24 h后显微镜拍照，图像分析仪测量划痕宽度。

1.5Transwell法检测细胞体外侵袭能力 各组以每孔5×104个细胞浓度接种于24孔Transwell小室中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，按“1.2”项方法干预24 h，取出小室，PBS洗涤后4%甲醛固定10 min，用0.1%结晶紫染色30 min，显微镜下计数紫色穿膜细胞数。

1.6蛋白免疫印迹法检测蛋白表达 各组以每孔5×104个细胞浓度接种于6孔板中，待细胞融合按“1.2”项方法干预24 h后获取细胞，据细胞量加入细胞蛋白抽提试剂裂解2 h；经SDS凝胶电泳后转至聚偏氟乙烯膜上，后用5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，然后加入PDGFB(1∶250)、PDGFRβ(1∶200)、p-PDGFRβ(1∶500)、PI3K(1∶300)、Akt(1∶200)、p-Akt(1∶300)和β-actin(1∶1000)抗体4 ℃条件下孵育过夜，TBST缓冲液冲洗膜2次，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)室温下孵育30 min后显色，采集图像分析。

2 结果

2.1不同浓度薏苡仁提取物对CAL27细胞增殖率和迁移能力的影响 高、低剂量组细胞增殖率和迁移能力明显低于对照组，且高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。见表1、图1和图2。

表1 不同浓度薏苡仁提取物对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞增殖和迁移能力的影响

图2 不同浓度薏苡仁提取物对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞迁移能力的影响

2.2不同浓度薏苡仁提取物对CAL27细胞侵袭的影响 对照组细胞侵袭数为(510.08±91.54)个，低、高剂量组细胞侵袭数分别为(257.89±56.28)个、(182.61±30.72)个。高、低剂量组细胞侵袭数低于对照组，且高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。见图3。

图3 不同浓度薏苡仁提取物对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞侵袭的影响(结晶紫染色×200)

2.3不同浓度薏苡仁提取物对CAL27细胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表达的影响 高、低剂量组PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表达低于对照组，且高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。见表2、图4。

图4 不同浓度薏苡仁提取物对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表达的影响

表2 不同浓度薏苡仁提取物对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表达的影响

2.4不同浓度薏苡仁提取物对CAL27细胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达的影响 3组Akt蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；高、低剂量组PI3K和p-Akt蛋白表达低于对照组，且高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。见表3、图5。

表3 不同浓度薏苡仁提取物对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达的影响

图5 不同浓度薏苡仁提取物对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达的影响

3 讨论

目前，OSCC发病率较高，多数患者因肿瘤复发或转移而造成死亡。故亟须寻找可以对OSCC细胞增殖和迁移起抑制作用的有效药物。薏苡仁甘油酯为薏苡仁提取物的主要成分，其成品制剂康莱特注射液已用于临床，对多种恶性肿瘤具有较好疗效，可明显促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖，并显著提高患者机体免疫功能[7-8]。然而，其具体的作用机制及最佳作用浓度仍不十分清楚。故本研究评估不同浓度薏苡仁提取物对人OSCC CAL27细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及作用机制，研究结果显示，高、低剂量组细胞增殖率、迁移能力、细胞侵袭数低于对照组，且高剂量组低于低剂量组。提示薏苡仁提取物可能是OSCC的潜在治疗靶点，且干预浓度越高抗肿瘤作用越佳。分析产生上述结果的原因为，薏苡仁提取物通过阻断G2与M期肿瘤细胞进入G0、G1期，并减少S期肿瘤细胞比例，减少细胞分裂，从而抑制肿瘤细胞增殖或肿瘤血管生成，起到良好的抗肿瘤效应。

PDGF是体外平滑肌细胞和成纤维细胞的主要促分裂原[9]。HOSAKA等[10]研究指出，肿瘤细胞增殖、迁移以及功能性脉管系统发育的关键为PDGFB和PDGFRβ间的相互作用。ZHOU等[11]研究显示，上调PDGFB表达可刺激血管损伤大鼠模型颈动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，提示PDGFB有助于动物模型血管损伤后的修复或重塑。TANNENBERG等[12]研究还发现，减少血管成形术后血管修复和重塑的关键是抑制PDGFB信号传导通路活性。VU等[13]和FORTE等[14]研究认为，在多种上皮癌自分泌刺激肿瘤生长及旁分泌刺激肿瘤相关血管生成过程中，PDGFB和PDGFRβ起关键作用。有研究显示，PDGFB主要在OSCC组织肿瘤细胞中表达升高[15]，激活PI3K/Akt信号传导通路可诱导肿瘤细胞生长并促进上皮间质转化和肿瘤细胞转移[16-17]。本研究结果显示，高、低剂量组PDGFB、PDGFRβ、p-PDGFRβ、PI3K、p-Akt蛋白表达低于对照组，且高剂量组低于低剂量组。提示薏苡仁提取物可能是通过抑制PDGFB表达，阻断PDGFRβ磷酸化并抑制PDGFB/PDGFRβ/PI3K/Akt轴活性，从而抑制人OSCC CAL27细胞增殖、迁移和侵袭能力，且干预浓度越高抗肿瘤效果越佳。

综上所述，薏苡仁提取物可抑制人OSCC CAL27细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制可能与抑制PDGFB/PDGFRβ/PI3K/Akt轴活性有关，且干预浓度越高抗肿瘤效果越佳，为薏苡仁提取物对OSCC的分子靶向治疗提供新的理论依据。