白藜芦醇通过MyD88/TLR4/NF-kB信号通路诱导结肠癌细胞凋亡的机制

乔 璐，杨 艳，唐代诗，杜 婷，顾 勇

白藜芦醇是一种多酚类化合物，主要来源于葡萄、花生和桑椹等植物，其中葡萄中含量较高。研究表明，白藜芦醇具有降低血小板聚集、预防和治疗动脉粥样硬化的作用，同时还可以抑制多种恶性肿瘤的发生发展，如食管癌、乳腺癌和肺癌等。目前，白藜芦醇如何影响结肠癌的发生发展及其具体机制尚不明确。本文通过体外实验研究白藜芦醇对结肠癌细胞凋亡的影响及其对结肠癌细胞MyD88/TLR4/NF-kB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂 HT-29、sw480和 LoVo结肠癌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。白藜芦醇、VEGF、MyD88、TRL4、NF-kB、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3抗体均购于美国Santa Cruz公司。反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒与引物均购于日本宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞体外培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，置于37 ℃，5%CO的培养箱中培养。收集对数生长期的结肠癌细胞(10/ml)培养在75 cm组织培养瓶，设定为：对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组(白藜芦醇0、25、50、100 μmol/L)处理结肠癌细胞，处理时间为24 h。

1.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡率 细胞培养后利用甲醛固定，加入0.1% Triton X-100通透细胞膜。根据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书加入TUNEL反应混合液，37 ℃孵育60 min，PBS洗涤后加入显色液。阳性表达为凋亡细胞核呈棕褐色(正常细胞核为蓝色)。每组实验独立重复3次，利用Image-Pro Plus 6.0 图像分析测量软件分析，计数每张照片阳性表达面积及累积光密度。

1.2.3 ELISA法检测细胞上清液中VEGF表达 收集各组处理后的对数生长期的细胞，胰酶消化后再4 ℃ 3000 r/min离心14 min，收集细胞上清液。参照ELISA试剂盒说明书检测0、25、50、100 μmol/L白藜芦醇处理后结肠癌细胞内VEGF表达变化，每组实验独立重复3次。

1.2.4 引物设计 检索基因文库中所要检测目的基因的cDNA序列，应用引物设计软件Primer 5.0设计引物(表1)，由日本宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.5 Western blot检测 收集各组处理后的对数生长期的HT-29、sw480和 LoVo细胞蛋白，并用BCA法进行定量。各组各取30 μg样品置于聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF膜。用2 ml的BSA封闭液封闭1 h，再加入2 ml MyD88、TLR4和NF-kB、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3和β-actin (1∶1000)一抗后4 ℃孵育过夜，次日通过ECL发光液进行显影。

1.2.6 RT-PCR 根据Trizol说明书提取对照组和不同剂量白藜芦醇处理组细胞中的总RNA，将提取的总RNA在65 ℃孵育5 min，再4 ℃孵育2 min。反转录利用Prime Script RT试剂盒完成。实时荧光定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒完成。将对照组的一个样品作为参照，其余样品均按下列公式计算与参照的比值，各组之间对比值进行统计分析。公式：ΔΔ=(-)-(-)，目的mRNA的量=2。

2 结 果

2.1 不同剂量白藜芦醇处理组结肠癌细胞凋亡结果 与对照组相比，随着白藜芦醇剂量的增加，结肠癌细胞HT-29、sw480和 LoVo的凋亡率显著上升，差异有统计学意义。在HT-29和LoVo细胞系中，低剂量处理组与对照组凋亡率比较，差异无统计学意义，中、高剂量组与对照组凋亡率对比，差异具有统计学意义(<0.05，表2)。ELISA检测结果显示，随着白藜芦醇剂量的增高，结肠癌细胞HT-29、sw480和 LoVo上清液中VEGF蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(<0.05，表2)。在sw480和LoVo细胞系中，低剂量处理组与对照组VEGF表达无统计学意义，中、高剂量组与对照组VEGF表达差异有统计学意义(<0.05，表2)。

2.2 不同剂量白藜芦醇处理组细胞凋亡关键分子表达变化 与对照组相比，随着白藜芦醇剂量的增高，结肠癌 HT-29、sw480和 LoVo细胞中Bcl-2的mRNA和蛋白含量表达明显降低，Bax和cleaved-Caspase 3的mRNA和蛋白含量表达明显升高，呈剂量依赖性，差异具有统计学意义(<0.05，图1，表3)。

2.3 不同剂量白藜芦醇处理组MyD88/TLR4/NF-kB信号通路中关键分子表达变化 与对照组相比，中高剂量组随着白藜芦醇剂量的增高，结肠癌HT-29、sw480和LoVo细胞中MyD88、TLR4和NF-kB的mRNA和蛋白表达均显著降低，差异具有统计学意义(<0.05，图1，表3)。低剂量组与对照组相比差异不具有统计学意义，可能与处理剂量及作用时间有关。

3 讨 论

白藜芦醇，又名芪三酚，3,4’,5-三羟基芪。目前研究已证实，白藜芦醇具有抑制肿瘤细胞血管生长、增殖、转移和侵袭的作用，可调节细胞周期，促进肿瘤细胞的凋亡分化，并增强肿瘤细胞的放射敏感性。对肝癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、食管癌、前列腺癌等多种肿瘤有明确的抗肿瘤作用，且白藜芦醇对正常细胞无毒性或仅具有较低毒性，有望成为新一代的抗肿瘤药物。但其对结肠癌的具体作用和机制仍有待进一步探究。

有研究发现，白藜芦醇可通过调节细胞周期蛋白A1表达，参与 p53 信号通路激活所致的细胞凋亡和增殖阻滞作用。p53 信号通路中的 Bcl-2 和Bax蛋白间的比例决定肿瘤细胞是否接受凋亡发生的信号。Bcl-2 家族成员与细胞凋亡密切相关，通过阻止线粒体细胞色素C 的释放而发挥抗凋亡作用；Bax是 Bcl-2 家族中参与细胞凋亡的一个重要成员，当细胞受到外界刺激促发凋亡机制时，Bax从胞质迁移至线粒体和核膜，导致包括细胞色素C在内的多种促凋亡蛋白的释放，并激活caspases，产生caspases级联反应执行细胞凋亡；而caspase-3 是细胞凋亡过程中最关键的执行分子之一，可以剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白。白藜芦醇能有效抑制 Bcl-2 蛋白的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，促进caspase-9和caspase-3表达，加速Hela细胞凋亡的发生。本研究通过TUNEL法检测白藜芦醇对于结肠癌细胞凋亡的影响，发现其能够显著抑制结肠癌细胞的凋亡，并呈剂量依赖性。本研究还发现白藜芦醇干预后结肠癌细胞中Bcl-2的mRNA和蛋白含量表达明显降低，Bax和cleaved-Caspase 3的mRNA和蛋白含量表达明显升高，呈剂量依赖性。我们还进一步检测了白藜芦醇对于结肠癌细胞VEGF的影响，发现白藜芦醇处理后结肠癌细胞上清液中VEGF蛋白表达明显降低，提示白藜芦醇可能还通过影响结肠癌血管生成而抑制肿瘤进展。

多项研究表明，白藜芦醇可通过激活 p53 依赖性和非依赖性途径、Fas依赖性途径、Wnt/β-catenin、JAK/STAT等信号通路诱导多种肿瘤细胞凋亡。经典的细胞信号转导通路MyD88/TLR4/NF-κB参与激活机体内的炎性反应、氧化应激和免疫调节等过程。近年来研究发现，MyD88/TLR4/NF-kB信号通路参与多种肿瘤的多个病理生理学过程。MyD88含有TLR结构域的接头蛋白，与Toll的结构域相互作用，进而募集白介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor associate kinase, IRAK),引起IRAK自身磷酸化，从而诱导肿瘤细胞释放多种因子等一系列效应促进肿瘤的发生发展。国内外研究结果显示TLR4在结肠癌组织中高表达，与淋巴结转移、临床 TNM分期有关，且与肿瘤细胞增殖指数和微血管密度有关，提示TLR4可能在促进结肠癌细胞增殖和间质血管新生方面起作用，进而影响结肠癌的淋巴结转移和临床分期。而白藜芦醇对于结肠癌MyD88/TLR4/NF-kB信号通路的作用有待进一步研究。本研究中利用白藜芦醇处理结肠癌细胞后，细胞中MyD88、TLR4和NF-kB蛋白和mRNA水平均显著下降，且呈剂量依赖性，提示白藜芦醇能够通过抑制MyD88/TLR4/NF-kB信号通路而参与结肠癌恶性生物学行为的调控。

综上所述，本研究初步探讨了白藜芦醇通过抑制结肠癌MyD88/TLR4/NF-kB信号通路促进细胞凋亡的机制，为白藜芦醇辅助治疗结肠癌提供了理论依据。但本研究仅对白藜芦醇体外的作用进行了分析研究，需要进一步研究其在体内的作用。