下调lncRNA-H19表达促进人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡和自噬

黄 云，许喜生，陈 凯，何 秀

(1.郴州市第一人民医院 烧伤整形外科，湖南 郴州 423000； 2.郴州市第一人民医院儿童医院 儿童呼吸内科，湖南 郴州 423000)

瘢痕疙瘩(keloid)俗称疤痕疙瘩，属于皮肤良性肿瘤的一种，也是困扰皮肤及伤口正常愈合的主要问题之一[1]。Keloid发病机制复杂且不明确，目前研究发现，成纤维细胞异常增殖及胞外基质异常沉积是keloid形成的主要病理表现[2]，抑制成纤维细胞过度增殖并促进其凋亡，对缓解keloid形成发展有一定的临床意义[3]。自噬在细胞凋亡、存活过程中发挥重要的调控作用[4]，其过度自噬及自噬不足，均可影响细胞的功能稳态而参与细胞凋亡及存活过程[5]。但自噬在keloid成纤维细胞(keloid fibroblasts，KFs)异常增殖中扮演怎样的角色，也一直存在争议[6]。长度大于200的非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可广泛参与细胞增殖、分化、衰老、凋亡、周期调控及X染色体印迹等多种生物学过程[7]，而受到临床研究的重视。已有研究发现lncRNA-H19在keloid组织表达中异常增高，且下调lncRNA-H19能抑制KFs增殖[8]，但lncRNA-H19下调是否能通过调控自噬，促进KFs凋亡，来缓解keloid病理进程，还不甚清楚。本研究体外培养KFs细胞，对此进行探讨，以期阐明lncRNA-H19在KFs自噬、凋亡中的靶向调控机制，为keloid的治疗提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞及主要试剂：人类瘢痕成纤维细胞系(KFs)(上海细胞研究所)；健康人皮肤成纤维细胞系(human dermal fibroblasts,HDFs)(上海朗生科技有限公司)；DMEM培养基[舜冉(上海)生物科技有限公司]；反转录试剂盒(上海研卉生物科技有限公司)；Ad-mTOR和ad-eGFP(规格200μL，腺病毒滴度为2×109PFU/mL,感染效率大于85%)(南京善本生物科技有限公司)；lncRNA-H19F低表达腺病毒(si-lncRNA-H19)及不含si-lncRNA-H19的空病毒载体(si-eGFP)[汉恒生物科技(上海)有限公司]；Caspase3及PARP、自噬标记蛋白-LC3Ⅱ、Atg7、mTOR及磷酸化mTOR(p-mTOR)和ULKl抗体(均Abcam公司)；吖啶橙(Ao)荧光染色试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理：取KFs及HDFs细胞系常规复苏后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在恒温培养箱中常规贴壁传代培养。

取对数期KFs及HDFs细胞，按6×104个/孔接种于6孔板内，并设置为HDFs组、KFs组、si-lncRNA-H19+KFs组、si-eGFP+KFs组，每组设置6个复孔。HDFs组及KFs组不做任何处理正常培养，si-lncRNA-H19+KFs组及si-eGFP+KFs组待KFs细胞汇合度达50%～60%时，采用腺病毒向KFs细胞感染lncRNA-H19低表达序列及空载体，记为si-lncRNA-H19+KFs组及si-eGFP+KFs组。各感染组于感染后24 h，取细胞进行后续试验，用qRT-PCR法检测各组细胞感染效果。

取KFs细胞，按1×105个/孔接种于96 孔板内，并设置为：KFs组(未感染组)、si-lncRNA-H19+Ad-mTOR组、si-eGFP+Ad-mTOR组、si-lncRNA-H19+Ad-eGFP组、si-eGFP+Ad-eGFP组，si-lncRNA-H19+Ad-mTOR组感染lncRNA-H19低表达腺病毒(si-lncRNA-H19)及mTOR过表达腺病毒(Ad-mTOR)；si-eGFP+Ad-mTOR组感染lncRNA-H19空载体腺病毒(si-eGFP)及Ad-mTOR，si-lncRNA-H19+Ad-eGFP组感染si-lncRNA-H19及mTOR空载体(Ad-eGFP)；si-eGFP+Ad-eGFP组感染si-eGFP及Ad-eGFP，各组均于感染后24 h，取细胞按1.2.6方法检测细胞凋亡与自噬相关蛋白表达。

1.2.2 qRT-PCR检测不同细胞系中lncRNA-H19相对表达水平：取对数期KFs及HDFs细胞，用RNA试剂盒提取总RNA，反转录试剂盒反转录得到cDNA，以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒进行PCR反应(反应体系：上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL，2×SYBR mix 10 μL，10×cDNA模板1 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火55 s，50个循环，72 ℃延伸15 min)。lncRNA-H19(上游引物：5′-TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG-3′，下游引物：5′-CGGAAGTAAGGTGGCTAGACC-3′)以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt算法，计算lncRNA-H19表达水平。

1.2.3 流式细胞测量术检测细胞凋亡率：细胞用胰蛋白酶消化6 min，1 000 r/min离心5 min，1 mL磷酸缓冲溶液重悬后合并沉淀物制成单细胞悬液，按annexinV-EGFP/PI双染试剂盒说明书方法进行，染色孵育后，在流式仪上进行上机检测。

1.2.4 透射电镜及吖啶橙(Ao)荧光染色观察细胞自噬：取细胞，沿培养皿壁加入戊二醛固定、包埋并制成切片后，置于透射电镜下观察细胞自噬小体及自噬溶酶体形成情况。

取细胞，制成单细胞悬液，用4%多聚甲醛固定10 min后，加入终浓度为5 μg/mL的Ao试剂，避光孵育10 min后，置于荧光显微镜下观察自噬泡形成情况。

1.2.5 免疫组化法检测细胞mTOR阳性表达：取细胞，制成单细胞悬液，用4%多聚甲醛固定10 min后，加入一抗抗体(mTOR，1∶500)4 ℃孵育6 h，加入辣根过氧化物酶标记二抗(1∶1 000)室温孵育30 min后，用DAB显色，苏木精复染后，置于显微镜下观察拍照。

1.2.6 Western blot检测细胞蛋白表达：取细胞，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法测定细胞蛋白浓度后，取50 μg蛋白样品行上样、电泳、转膜反应，加入一抗caspase3、PARP、mTOR、p-mTOR、ULKl抗体(1∶1 500)，内参抗体GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶二抗(1∶3 000)，室温下孵育4 h。显影曝光后，用化学发光成像分析系统拍照并分析灰度值。每组试验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同细胞系中lncRNA-H19表达变化

瘢痕成纤维细胞系(KFs)中lncRNA-H19表达为(2.06±0.13)，显著高于正常皮肤成纤维细胞系(HDFs)的(1.09±0.08)(P<0.05)。

2.2 下调lncRNA-H19表达后对KFs细胞lncRNA-H19表达的影响

与HDFs组比较，KFs组细胞lncRNA-H19表达升高(P<0.05)；与KFs组相比，si-lncRNA-H19+KFs组细胞lncRNA-H19表达降低(P<0.05)(表1)。

表1 细胞lncRNA-H19表达比较

2.3 下调lncRNA-H19表达后对KFs细胞凋亡的影响

与KFs组细胞相比，si-lncRNA-H19+KFs组细胞凋亡率升高(P<0.05)(图1，表2)。

图1 各组细胞流式凋亡图Fig 1 Flow cytometric diagram of cell apoptosis in each group

表2 各组细胞凋亡率比较

2.4 下调lncRNA-H19表达后对细胞自噬的影响

HDFs组细胞粗面内质网及高尔基体丰富、线粒体结构正常，偶见个别线粒体肿胀及自噬小体和自噬溶酶体出现；KFs组及si-eGFP+KFs组可见多个粗面内质网肿胀、扩张，内含大量胶原蛋白，线粒体大量肿胀，胞质内有大量细胞器残体；si-lncRNA-H19+KFs组可见大量双层膜囊泡样结构的自噬小体包绕胞质或细胞器，大量单层膜结构的自噬溶酶体内含部分尚未分解的内质网、线粒体等细胞器残体(图2)。

→indicate autophagosome and auto lysosome图2 细胞电镜观察图Fig 2 Electron microscope observation of cells (×80 00)

2.5 下调lncRNA-H19表达后对细胞自噬泡形成数目的影响

与HDFs组比较，KFs组细胞自噬泡形成数目降低(P<0.05)，mTOR阳性表达升高(P<0.05)；与KFs组细胞相比，si-lncRNA-H19+KFs组细胞自噬泡形成数目升高(P<0.05)，mTOR阳性表达降低(P<0.05)(图3，表3)。

2.6 下调lncRNA-H19表达后对细胞凋亡及自噬相关蛋白表达的影响

与HDFs组比较，KFs组细胞caspase3、PARP、LC3Ⅱ、Atg7、ULKl蛋白表达降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表达升高(P<0.05)；与KFs组细胞相比，si-lncRNA-H19+KFs组细胞caspase3、PARP、LC3Ⅱ、Atg7、ULKl蛋白表达升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表达降低(P<0.05)(图4，5)。

→indicate autophastc vesicles图3 各组细胞Ao染色图Fig 3 Ao staining image of cells in each group (×400)

表3 各组细胞自噬泡形成数目比较

2.7 si-lncRNA与Ad-mTOR共感染后对细胞凋亡及自噬相关蛋白表达的影响

与KFs组比较，si-eGFP+Ad-mTOR组细胞caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表达降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表达升高(P<0.05)；si-lncRNA-H19+Ad-eGFP组细胞caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表达升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表达降低(P<0.05)。与si-lncRNA-H19+Ad-eGFP组相比，si-lncRNA-H19+Ad-mTOR组caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表达降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表达升高(P<0.05)(图6，7)。

A.HDFs；B.KFs；C.si-lncRNA-H19+KFs;D.si-eGFP+KFs图4 各组细胞凋亡及自噬相关蛋白表达免疫印迹图Fig 4 Immunoblotting diagram of apoptosis and autophagy-related protein expression in each group

*P<0.05 compared with HDFs group；#P<0.05 compared with KFs group图5 各组细胞中凋亡及自噬相关蛋白表达水平比较Fig 5 Comparison of the expression levels of apoptosis and autophagy-related proteins in each group of cells

A.KFs；B.si-lncRNA-H19+Ad-eGFP；C.si-lncRNA-H19+Ad-mTOR；D.si-eGFP+Ad-mTOR；E.si-eGFP+Ad-eGFP图6 各组细胞凋亡及自噬相关蛋白表达免疫印迹图Fig 6 Immunoblotting diagram of apoptosis and autophagy-related protein expression in each group

3 讨论

Keloid好发于10～30岁的健康人群，约有86%keloid患者产生难以控制的瘙痒症状，并在很大程度上给患者造成心理自卑及社交障碍[9]。Keloid发生机制不明，临床上仍无特殊有效的方法延缓并根治keloid。KFs异常增生和胞外基质过度沉积被认为是keloid形成的主要病理表现，寻找抑制KFs增生、促进KFs凋亡的有效方法，是临床研究keloid的重点方向。lncRNA-H19能通过调控原癌基因表达、编码生长因子及相关受体表达， 来参与细胞增殖及分化过程[10]。lncRNA-H19在keloid组织中表达异常升高，敲低lncRNA-H19后，可降低lncRNA-H19对相关RNA调控作用，达到抑制KFs增殖、促进KFs凋亡的目的，并认为lncRNA-H19可能是keloid治疗的潜在靶点[11]。本研究发现敲低lncRNA-H19后，KFs凋亡异常升高，证实下调lncRNA-H19表达可促进KFs凋亡，影响KFs存活。

自噬与肿瘤细胞凋亡关系密切。肿瘤早期，自噬激活可通过自噬性死亡的方式发挥抑制肿瘤增殖作用，而在后期，自噬激活却能通过分解、吸收、回收利用代谢物质的方式，满足肿瘤对能量和营养的需求，促进肿瘤细胞存活[12]。但自噬在keloid过程中扮演怎样的角色，也一直存在争议。在自噬调控过程中，Atg7可与LC3结合形成泛素链参与自噬泡的形成，且LC3Ⅱ或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的变化可判断自噬处于自噬激活还是抑制状态[13]。另外，mTOR通路也是自噬调控的核心通路之一，大量研究发现，mTOR中的mTORC1磷酸化激活后，可影响自噬基因ULKl复合体形成，抑制自噬泡的生成，且mTOR通路活化与keloid形成机制有关[14]。本研究发现，KFs细胞中mTOR活性升高的同时，KFs细胞自噬处于抑制状态，提示mTOR通路活化介导的自噬抑制，可能与KFs凋亡降低关系密切。lncRNA-H19可激活mTOR途径，诱导细胞自噬激活[15]。本研究发现，敲低lncRNA-H19后，KFs细胞mTOR活性降低，细胞自噬及凋亡活性显著升高。但敲低lncRNA-H19的同时， 促进mTOR活性， lncRNA-H19低表达发挥的抑制mTOR活化、促进KFs细胞自噬及凋亡作用被明显减弱。

*P<0.05 campared with KFs； #P<0.05 campared with si-lncRNA-H19+Ad-eGFP图7 各组细胞中凋亡及自噬相关蛋白表达比较Fig 7 Comparison of apoptosis and autophagy-related protein expression in cells of each group

综上所述，下调lncRNA-H19表达，可抑制mTOR途径活化，促进KFs细胞自噬及凋亡。这为阐明keloid病理发生发展机制提供一定理论依据，但细胞凋亡与自噬关系复杂，涉及多个RNA及靶蛋白的调控，lncRNA-H19与mTOR及自噬等的靶向调控作用，还有待进一步探究。