脓毒症早期BMP-2和BMP-4的变化

温 燕，林金灿，黄颖泓，肖文彪，张民伟，林建东*

(1.福建医科大学附属第一医院 重症医学科， 福建 福州 350005； 2.厦门大学附属第一医院 重症医学科，福建 厦门 361003)

脓毒症(sepsis)定义为，由感染引起的机体反应失调所致的危及生命的器官功能障碍[1]。在脓毒症的病理过程中，血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)是病原体及其毒素的主要靶点。已证实内皮功能障碍早期参与了脓毒症的发生发展[2]。因此，早期评估脓毒症内皮细胞损伤，可为脓毒症诊断和治疗提供有价值的信息。

研究表明，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族的不同亚型与血管生物学有关。BMP信号主要由BMP-2/4/6/9/10触发，其中BMP-2和BMP-4存在于人微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells，MECs)中，调节EC的迁移和毛细血管的形成[3-4]，BMP-2和BMP-4表达上调可诱导内皮促炎表型，增强白细胞与内皮的间黏附[5-7]。这表明，BMP-2/4信号级联反应可影响内皮细胞生物学行为，BMP-2/4信号通路可能成为内皮细胞损伤修复的潜在靶点。

然而，目前关于BMP-2/4信号通路的研究多集中于大血管内皮细胞，BMP-2/4在脓毒症微血管内皮功能障碍中的作用尚未明确。因此，本研究旨在探讨BMP-2和BMP-4在脓毒症早期的变化及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试者：根据2016年脓毒症国际指南诊断脓毒症[1]。入选自2017年5月1日至2020年5月1日入住厦门大学附属第一医院重症监护病房(intensive care unit，ICU)和福建医科大学附属第一医院 ICU 的脓毒症患者(脓毒症组)和非脓毒症患者(非脓毒症组)。招募18岁以上的健康志愿者作为对照组。脓毒症组的入选标准：1)年龄>18周岁；2)确诊脓毒症；3)脓毒症的上游疾病为细菌性肺部感染或腹腔感染。非脓毒症组的入选标准：1)年龄>18周岁；2)轻型肺部细菌感染患者或因腹部器官非感染性疾病入住ICU的患者；3)ICU住院期间无新发感染。脓毒症组和非脓毒症组的排除标准为：1)自身免疫性疾病；2)肿瘤活动期；3)骨修复期；4)肺血管疾病如肺动脉高压、肺栓塞等。健康对照组的排除标准为:1)入组前1个月内患有细菌或病毒感染；2)入组前1个月内接受过抗生素治疗。该研究经福建医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准[闽医大附一伦理医研(2021204)]。所有受试者或其法定监护人需签署知情同意书。该研究符合1975年赫尔辛基宣言的伦理准则。

收集所有受试者的一般信息，及脓毒症组和非脓毒症组的感染性指标。

1.1.2 试剂及试剂盒：BMP-2、BMP-4和内皮素-1(endothelin-1，ET-1)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(博士德生物技术有限公司)，总 RNA 纯化试剂盒、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)结合的山羊抗兔 IgG 抗体和 DAB 显色液(上海生工生物技术有限公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒和TaqMan探针(TaKaRa公司)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma-Aldrich公司)；抗BMP-2抗体、抗磷酸化 Smad1/5(phosphorylated Smad1/5，pSmad1/5)抗体和抗BMP受体Ⅱ(BMP receptor Ⅱ，BMPRⅡ)抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.3 细胞：原代大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells，RPMECs)(武汉普诺赛生命科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 采集血样：收集脓毒症组(24例)和非脓毒症组(25例)患者入住 ICU 24 h 内及健康志愿者(对照组，24例)的空腹外周静脉血标本，离心获得血清，将血清样品等分后，-20 ℃ 保存。

1.2.2 ELISA定量检测BMP2、BMP-4和 ET-1：按照试剂盒说明书，测定血清 BMP-2、BMP-4和 ET-1浓度。用酶标仪在波长450 nm处测定吸光度(A)值。

1.2.3 RPMECs 的培养和处理:于37 ℃含5% CO2的培养箱培养原代 RPMECs。第2～3代的 RPMECs 用于实验。用梯度浓度的 LPS(0、10、100和1 000 ng/mL)孵育 RPMECs[8]，3 h 后收集 RPMECs，提取总蛋白和总 RNA。

1.2.4 免疫印迹法检测BMP-2、pSmad1/5和 BMPRⅡ：用1.2.3中的 RPMECs 总蛋白，按文献报道[8]的方法进行免疫印迹分析；用Image J软件分析蛋白质的相对表达量。

1.2.5 RT-qPCR检测 BMP-2 mRNA和 BMPRⅡ mRNA：用1.2.3中的 RPMECs总 RNA，按PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒说明进行反转录。用 LightCycler480系统和 Taqman 探针进行 qPCR。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 受试者一般特征

最终入选24例脓毒症患者(脓毒症组，n=24)、25例非脓毒症患者(非脓毒症组，n=25)及24例健康志愿者(对照组，n=24)。与非脓毒症组相比，脓毒症组患者入ICU后24 h 内的感染性标志物水平显著较高，包括血小板(platelet，PLT)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)和白介素(interleukin，IL)-6(P<0.05)；脓毒症组死亡率显著较高，有更多的患者合并有多器官功能衰竭综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、需要机械通气，且机械通气时间显著较长(P<0.05)。

2.2 脓毒症患者中血 BMP-2和 BMP-4的浓度显著升高

脓毒症组早期血清 BMP-2 和 BMP-4 水平显著较高于对照组(P<0.05)，且脓毒症组 BMP-2水平显著高于非脓毒症组(P<0.01)(图1)。

There were significant differences on BMP-4(F=3.79，P=0.03) and BMP-2(F=6.36，P=0.003) between the three groups; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with non-sepsis图1 脓毒症组、非脓毒症组和对照组间BMP-2、BMP-4和ET-1的比较Fig 1 Comparisons of BMP-2, BMP-4 and ET-1 between sepsis group, non-sepsis group and control group

2.3 BMP与脓毒症相关的生物标志物之间的相关性

Pearson相关性分析显示，脓毒症组患者入住 ICU 24 h 内的 BMP-2 水平与 PCT(r=0.45，P<0.01)、乳酸(r=0.66，P<0.01)、以及 IL-6(r=0.59，P<0.01)呈显著正相关，且其BMP-4 与 ET-1(r=0.57，P<0.01)和 CRP(r=0.54，P<0.05)间亦呈显著正相关；而非脓毒症组仅 BMP-4 与 CRP(r=0.66，P<0.01)呈显著正相关。

2.4 BMP-2具有良好的脓毒症诊断性能

ROC 曲线分析 BMP-2 对脓毒症与健康志愿者诊断价值，结果显示出良好诊断性能(AUC=0.94，cutoff 值：50.40 pg/mL，灵敏度：87.50%，特异性：95.83%)；且BMP-2在区分脓毒症患者与ICU非脓毒症患者时(AUC=0.85，cutoff 值: 54.66 pg/mL，灵敏度:87.50%，特异性: 76.00%)也显示出良好诊断性能。本研究中所有ROC 曲线分析均未显示BMP-4对脓毒症的良好诊断性能。

2.5 LPS 对RPMECs的SMAD信号通路蛋白表达的影响

2.5.1 LPS处理的RPMECs的BMP-2表达的变化：LPS可诱导 RPMECs的BMP-2表达增加，且该效应具有LPS浓度依赖性(图2A,B)。当 LPS 浓度≥100 ng/mL 时，经 LPS 处理的 RPMECs 的 BMP-2 表达显著高于对照组(P<0.05，图2A,B)。

2.5.2 LPS对RPMECs 的 BMP/Smad1/5/8信号通路的影响：LPS 可显著降低 RPMECs 的pSmad1/5和 BMPRⅡ 表达，且降低程度均与LPS浓度呈剂量依赖关系(P<0.05)(图3A～C)，另外BMPRⅡ mRNA的表达显著降低(P<0.05)(图3D)。

A.expression of BMP-2 detected by Western blot; B.relative expressions of BMP-2 of RPMECs grouped by concentrations of LPS; *P<0.05 compared with control group

A-C.expressions of pSmad1/5 and BMPRⅡ in LPS-treated PMECs were lower than them in untreated PMECs; D.RT-qPCR showed mRNA expressions of BMPRⅡ in LPS-treated PMECs lower than them in untreated PMECs; *P<0.05 compared with group control; #P<0.05 compared with non-sepsis group

3 讨论

非感染性炎性研究表明，BMP-2/4在血管炎性反应中表达显著上调，是血管壁中的促炎和促动脉粥样硬化因子[5-6,9-10]。这提示BMP可参与人体炎性反应。尽管研究表明，经LPS处理的小鼠肺部BMP-2表达显著升高[7]，但极少有研究报道BMP在临床感染性疾病中变化。本研究经临床观察首次证实脓毒症早期BMP-2/4水平显著升高，且BMP-2对感染性炎性反应更加敏感，并对脓毒症有良好的诊断功能，可能在早期脓毒症的诊断中起重要作用。

内皮细胞炎性是脓毒症的关键病理生理特征，主要表现为肺微血管完整性受损和内皮功能障碍[1,2]。通过细胞模型，本研究发现经LPS处理的RPMECs的BMP-2的表达明显更高，这进一步证实了上述临床发现。既往研究表明，BMP-2可促进白细胞黏附内皮细胞，这将诱导细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和核因子-κB的表达升高，从而引起内皮细胞炎性反应[7]。由BMP-2诱导产生的炎性因子又可下调BMP受体表达，进而经Smad1/5/8通路抑制BMP信号传导，从而增加内皮细胞中的ICAM表达和白细胞黏附[11-13]。本研究显示经LPS处理的肺微血管内皮细胞的磷酸化Smad1/5和BMPRⅡ表达显著受抑制。这表明在脓毒症早期，BMP-2在发挥促炎作用的同时，伴有Smad1/5/8信号通路抑制，这进一步加剧了促炎反应过程。

综上所述，本研究证实脓毒症早期BMP-2表达显著升高，LPS可抑制Smad1/5/8信号通路，两者共同驱动内皮细胞炎性反应。这表明BMP-2可能是潜在的脓毒症早期诊断标志物且在脓毒症早期起促炎作用。