中华猕猴桃黄烷酮3- 羟化酶基因克隆及其生物信息学分析

徐雅雯，陈如意，张 乐，郭志平，李嘉诚，朱群茵

（1.丽水学院 生态学院，浙江 丽水 323000；2.丽水学院医学院，浙江 丽水 323000）

中华猕猴桃（Actinidia chinensis），也称奇异果，是一种品质鲜嫩、营养丰富、风味鲜美的水果。在植物内部的各种器官和组织中分布有不同含量的黄酮类化合物。而黄酮类化合物作为猕猴桃果实内主要的活性成分，也是果实中最主要的多酚类物质，具有多种生物和药理活性，可以起到抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[1]。黄酮类物质合成途径分支点的核心酶众多，其中黄烷酮3- 羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）的主要作用为催化4，5，7，- 黄烷酮C 位的羟化，从而生成花青素、前花色素苷、黄酮醇的前体物质——二氢山奈素（dihydrok-aempferol，DHK）[2-3]。虽然F3H可以单独调控代谢，但是在黄酮类化合物的合成过程中F3H常和该途径查尔酮异构酶、查尔酮合成酶等合作[4-6]。F3H基因的克隆和代谢早已在拟南芥（Arabidopsisthaliana）[7]、水稻（Oryza sativa）[3]和其他物种中有报道，但在中华猕猴桃中还没有关于F3H基因克隆的报道。因此本研究采取RT-PCR 克隆中华猕猴桃F3H基因cDNA 序列并对其进行生物信息学分析，为进一步研究中华猕猴桃中F3H基因结构和功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

从丽水府前农贸市场购买重量相等、大小一致、形状相似、成熟程度一致的新鲜中华猕猴桃。

1.2 中华猕猴桃总RNA 提取与反转录

总RNA 的提取参照梅晓宏[8]的方法。取新鲜中华猕猴桃果实在液氮中研磨成粉，加入异硫氰酸胍提取剂，再加入醋酸钾、100%冰乙醇及1/10 体积的醋酸钠，颠倒混匀，再加入水饱和酚及氯仿- 异戊醇，混匀，离心取上清；加入异戊醇，于-20 ℃沉淀，离心；加1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，用适量的DEPC 水溶解RNA，随后琼脂糖凝胶电泳检测。以提取得到的总RNA 为模板，采用碧云天BeyoRTTMⅢcDNA 合成预混液（5X）进行反转录，取Total RNA 1 μL、DEPC-treated Water 6 μL、BeyoRTTMⅢcDNA 合成预混液（5X）4 μL形成20 μL 的反应体系；随后42 ℃下孵育30 min，80 ℃下孵育10 min，获取cDNA 第一链。

1.3 中华猕猴桃F3H 基因cDNA 克隆

根据NCBI 数据库中华猕猴桃F3H基因cDNA 序列（登录号：FJ542819），分别设计上游引物：5’-GGGGGAGAGAGAGAGAGAGA-3’；下游引物：5’-CAATCTCAAACTTGGCATCCA-3’。反应条件为：94 ℃下预变性5 min；94 ℃30s，53 ℃30s，72 ℃60s，共33 个循环，最后在72 ℃下延伸10 min。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，切胶回收后送生工测序。

1.4 生物信息学分析

利用ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测中华猕猴桃F3H基因cDNA 开放阅读框；利用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）预测中华猕猴桃F3H理化性质；利用ProP 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProP-1.0/）分析中华猕猴桃F3H蛋白信号肽和前导肽。使用ClustalW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）进行多序列比对；通过SWISSMODLE（https://swissmodel.expasy.org/interactive）预测中华猕猴桃F3H蛋白三维结构。利用MEGA 6.0 采用邻接法构建系统进化树，1 000 次Bootstraps，其他参数均为默认值。

2 结果与分析

2.1 中华猕猴桃F3H 蛋白分子特征

中华猕猴桃F3H基因cDNA 序列包含1 364 个核苷酸，其中包括一个含有1 101 个核苷酸的开放阅读框，可编码366 个氨基酸（图1）。对中华猕猴桃F3H蛋白的理化性质进行预测，结果显示中华猕猴桃F3H分子质量为40.89 kDa，理论等电点为5.40。中华猕猴桃F3H蛋白中不含前导肽和信号肽（图2）。

图1 中华猕猴桃F3H 基因cNDA 及其编码氨基酸序列

图2 中华猕猴桃F3H 蛋白信号肽和前导肽预测

2.2 F3H 氨基酸序列对比

根据多序列比对可知，中华猕猴桃F3H蛋白含有5 个保守基序（图3）。其中参与Fe2+的结合是基序4中的His218、Asp220 和基序5 中的His276。基序5 中的Arg286 和Ser288 参与2- 酮戊二酸的结合，这些保守基序也存在于其他植物F3H氨基酸序列中。而在基序2 和基序3 中，存在3 个被认为在F3H蛋白质的折叠过程中起重要作用的严格保守的脯氨酸（Pro148、204、207）。

图3 中华猕猴桃F3H 与其他植物F3H氨基酸序列对比

2.3 同源性分析

同源性分析结果表明，中华猕猴桃F3H氨基酸序列与浙江红山茶的一致性最高（90.22%），其次与杨梅的一致性为89.89%，与枣的F3H一致性最低（87.98%）。这与多序列比对的结果相一致（表1）。

表1 中华猕猴桃F3H 与其他植物一致性分析

2.4 中华猕猴桃F3H 蛋白结构分析

中华猕猴桃F3H蛋白的二级结构预测表明，该蛋白结构以α- 螺旋为主，占41.7%，其次为随机卷曲，占36.9%，占比最低的是β- 折叠，为21.4%。猕猴桃F3H蛋白三维结构预测发现，该蛋白含有His218、Asp220 和His276 三个铁离子结合位点以及两个参与2-O- 酮戊二酸合成的结合位点（Arg286、Ser288）（图4）。

图4 中华猕猴桃F3H 蛋白三维结构

2.5 F3H蛋白的系统进化树分析

系统进化树结果显示，中华猕猴桃F3H氨基酸序列与葡萄F3H氨基酸序列进化关系最为接近，同时与藤茶、枣、胡桃、川黔千金榆、栗、欧洲栓皮栎的F3H氨基酸序列聚为一大簇，说明中华猕猴桃F3H在进化上的保守性（图5）。

图5 中华猕猴桃F3H 与其他植物F3H 的系统进化树分析

3 讨 论

随着植物多酚化学和药理学的不断发展，人们慢慢认识到多酚类物质是具有独特生理活性和药理活性的天然产物[9]。黄酮类化合物作为一类多酚化合物，是植物中一类重要的有效成分，具有镇静、利尿和抗氧化和抗癌等重要作用[10]。F3H基因作为核心类黄酮花青素途径的关键结构基因之一[11]，越来越受到人们的关注。因此本研究对中华猕猴桃F3H基因cDNA 进行了克隆和生物信息学分析。通过对中华猕猴桃F3H蛋白的预测，可知中华猕猴桃F3H蛋白中不含信号肽和前导肽，与其他植物的F3H蛋白相一致[12-13]。多序列对比结果表明，在氨基酸水平上，中华猕猴桃F3H与其他植物的F3H相似性较高，且中华猕猴桃F3H氨基酸中的5 个保守基序也包含了Fe2+结合基序和2- 酮戊二酸结合基序2 个在大多数植物F3H都有所涉及的保守基序[12-13]，进一步说明了该基因具有较高的保守性。分析系统进化结果显示中华猕猴桃F3H与葡萄、藤茶、枣等亲缘关系较近，而与荔枝、龙眼等亲缘关系较远，在一定程度上体现了植物形态上的分类学差异，这与紫肉甘薯（Ipomopea batatas）[14]和滇水金凤（Impatiens uliginosa）[15]结果一致。本研究为调节中华猕猴桃F3H的活性以增加黄酮类化合物含量奠定基础，为高黄酮中华猕猴桃新品种研发提供了基础数据。