一株多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药性及分子分型

林 德，李斯彦，谢海柔，赵淑芳*

（1.丽水学院附属第一医院 检验科，浙江 丽水 323000；2.丽水学院医学院，浙江 丽水 323000）

肺炎克雷伯菌是社区和医院感染的重要致病菌，为革兰氏阴性杆菌。肺炎克雷伯菌具有荚膜，分泌黏液，常常引起肺炎、败血症、尿路感染等症状，病死率较高[1]。随着广谱抗菌素的广泛使用，细菌易产生耐药性。

碳青霉烯酶类抗生素属于β- 内酰胺酶抗生素的一类，能有效治疗超广谱β- 内酰胺酶和持续高产头孢菌素酶的革兰氏阴性杆菌感染，包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等,是目前临床上治疗产ESBLs 和AmpC 酶肺炎克雷伯菌感染的首选药物[2]。随着碳青霉烯酶类抗生素的广泛应用，耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌不断出现，给临床治疗和院感控制带来挑战。

肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制主要包括：碳青霉烯酶的产生、细菌外膜通透性的下降、外膜主动外排泵系统的表达、细菌生物膜的形成以及细菌抗生素靶位的改变等[3-4]。其中产碳青霉烯酶是引起碳青霉烯类抗菌药物耐药的最主要机制[5]。碳青霉烯酶包括3 类：A 类，即获得性碳青霉烯水解酶（2f 群），包括KPC，NMC，IMI，SME，GES，BIC 等；B 类，即金属酶，包括IMP，NDM，VIM，GIM 等；D 类，即OXA 酶，包括OXA23，OXA24，OXA25，OXA26，OXA27，OXA-48，OXA-51，OXA-58 等[6-8]。

2001 年，Yigit 等首次发现了一种新型的非金属碳青霉烯酶KPC-1[9]。我国浙江地区于2004 年发现并报道了产KPC-2 碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌菌株[10]。KPC 酶包含多个亚型，主要以KPC-2 和KPC-3 为主[11]。我国最常见的肺炎克雷伯菌是产碳青霉烯酶KPC-2 的ST11 型菌株[10-12]。

经鉴定，我们从临床分离的肺炎克雷伯菌多重耐药菌株的分子分型为ST11，产KPC-2 碳青霉烯酶。1 材料与方法

1.1 实验材料

2016 年从丽水市临床医院获得疑似肺炎克雷伯菌株1 株。

1.2 仪器和试剂

全自动快速生物质谱检测系统IVD MALDI Biotyper 2.3（德国BRUKER 公司）；PCR 仪（美国BioRad公司）；电泳仪(美国BioRad 公司)；凝胶成像系统（美国BioRad 公司）；药敏片购自英国OXOID 公司；肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 和肺炎克雷伯菌ATCC 700603 购自北京普天同创生物科技有限公司，大肠埃希菌ATCC 25922 为丽水市人民医院检验科实验室保存的菌株。PCR 试剂购自康为世纪生物科技股份有限公司。MH 培养基购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株鉴定采用全自动快速生物质谱检测系统IVD MALDI Biotyper 2.3 进行质谱分析并快速鉴定。挑选出优势单菌落涂布于靶板上，取1μL 的细菌测试标准品作为质量控制。待样本干燥后，加入1μL基质液，晾干，放入仪器中进行检测。依据Bruker 公司的推荐方法校正、比对、打分，最终得出鉴定结果。利用MALDI-Biotyper 数据库软件进行PCA 分析并构建发育树，对待测菌进行同源性分析[13-14]。

1.3.2 药敏试验

所采用的抗菌药物为：头孢他啶、环丙沙星、呋喃妥因、复方新诺明、阿米卡星、哌拉西林、亚胺培南、美罗培南、厄他培南。药敏程度解读参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）2021 标准执行[15]，肺炎克雷伯菌ATCC 700603 和大肠埃希菌ATCC 25922 为对照菌株。

1.3.3 mCIM 试验

依据文献［16］的方法进行mCIM 试验，即取1μL 接种环的细菌于2 mLTSB 培养基中，震荡14 s；将10μg 美罗培南药敏片（MEM）浸入菌悬液中，35 ℃培养4 h；在上述菌悬液培养了约3 h 后，配制0.5 麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC25922 菌悬液。用无菌棉签均匀涂布在MH 琼脂板上，在15 min 内完成，干燥3～10 min；4 h 培养结束后，取出MEM药敏片，挤去多余的菌液，贴至上述涂布了ATCC25922 菌悬液的MH 琼脂平板上，35 ℃培养18～24 h；测量抑菌圈的直径（mm） 并记录。其中肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 作为阳性对照菌株，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 作为阴性对照菌株[16]。

1.3.4 PCR 检测

用煮沸法提取细菌DNA[17]，采用PCR 方法扩增耐药相关基因blaKPC-2，blaBIC，blaIMP，blaAIM，blaGIM，blaNDM，blaDIM，blaSME，blaOXA-48和外膜孔蛋白基因blaOmpk-35，blaOmpk-36。大肠埃希菌ATCC 25922 作为阴性对照。

PCR 具体程序：95 ℃处理5 min；95℃变性45 s，在退火温度退火45 s，72 ℃延伸30 s，进行30 次循环，最后72 ℃延伸5 min。具体引物、退火温度和PCR 产物长度，见表1。

表1 （续）

表1 肺炎克雷伯菌的耐药相关基因及外膜孔蛋白基因的PCR 引物

1.3.5 多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）

对MLST website 提供的肺炎克雷伯菌的7 个管家基因（gapA，infB，mdh，pgi，phoE，rpoB 和tonB）的引物（表2）进行合成，再按照网站提供的PCR 程序进行PCR 扩增[14]，产物直接送上海生工生物工程有限公司进行纯化并测序，再对测序结果进行比对。

表2 肺炎克雷伯菌的7 个管家基因的PCR 引物

2 结 果

2.1 实验菌株的药敏结果

依文献［15］判断药敏结果。该菌株对头孢他啶、环丙沙星、呋喃妥因、复方新诺明、哌拉西林、亚胺培南、美罗培南、厄他培南8 种药物耐药，仅对阿米卡星敏感（表3）。

表3 实验菌株对9 种抗生素的药敏试验结果

2.2 实验菌株的mCIM 表型试验结果

依文献［16］判断mCIM结果。测量实验菌株的美罗培南药敏片的抑菌圈直径（d）为6 mm，实验菌株的mCIM 表型试验为阳性（图1），说明该菌株为表达碳青霉烯酶的表型。其中肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 作为阳性对照菌株（抑菌圈直径d=6 mm），肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 作为阴性对照菌株（抑菌圈直径d=21 mm）。

图1 mCIM表型试验

2.3 实验菌株的耐药相关基因检测结果

PCR 扩增设计的blaKPC-2基因的产物大小为784 bp，PCR 结果显示实验菌株检测出耐药相关基因blaKPC-2特异条带（图2），未检测出其他耐药相关基因blaBIC，blaIMP，blaAIM，blaGIM，blaNDM，blaDIM，blaSME，blaOXA-48，检测出正常的外膜孔蛋白基因blaOmpk-35和blaOmpk-36，未检测到缺失片段的外膜孔蛋白基因。大肠埃希菌ATCC 25922 作为阴性对照菌株。将blaKPC-2扩增出的特异条带进行胶回收后送测序，经比对，测序结果为blaKPC-2基因的序列片段。

图2 PCR 扩增结果

2.4 实验菌株的MLST 基因分子分型结果

将实验菌株的gapA，infB，mdh，pgi，phoE，rpoB 和tonB 这7 个基因扩增后，送上海生工生物工程有限公司测序，提交测序结果至MLST 分型网站，显示该菌株MLST 分型为ST11 型。

3 讨 论

本研究的肺炎克雷伯菌菌株为多重耐药且表达碳青霉烯酶KPC-2 的ST11 型菌株。产KPC-2 的肺炎克雷伯菌主要以ST258 型和ST11 型为主[11]。在欧美国家主要流行ST258 序列型，该序列型的菌株主要为多重耐药的[18]，而我国最常见的肺炎克雷伯菌是产碳青霉烯酶KPC-2 的ST11 型菌株[10-12]。同时，产碳青霉烯酶KPC-2 和KPC-3 的菌株是最常见的菌株类型[18]。

本研究中的ST11 型耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌对多种抗生素耐药，但对阿米卡星敏感，阿米卡星属于氨基糖苷类抗生素。有报道表明ST11 型的耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药[12]，这与本研究的结果相反。也有研究表明耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌对阿米卡星敏感[19]，与本研究结果一致。有文献报道用氨基糖苷类抗生素和其他抗生素联合治疗耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌引起的疾病，取得了一定的疗效[12，20]。但临床上较少单独使用阿米卡星来进行治疗，因为阿米卡星具有较大的肾毒性。

本研究中携带blaKPC-2耐药基因的多重耐药肺炎克雷伯菌菌株对头孢他啶、环丙沙星、呋喃妥因、复方新诺明、哌拉西林、亚胺培南、美罗培南、厄他培南8 种药物均耐药，仅对阿米卡星敏感。本研究将给临床医疗工作人员在治疗耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的感染及用药选择上提供线索和参考。