雌孕激素联合对实验性大鼠口腔溃疡的治疗作用

胡佳敏，宋兆侠，陈铭悦，陈永吉，纪 悦，杨如会*

（1.丽水学院医学院，浙江 丽水 323000；2.丽水市妇幼保健院孕产保健科，浙江 丽水 323000）

口腔溃疡，是指口腔黏膜的溃疡性损伤病症，常呈圆形或卵圆形，直径在1mm 至10 mm 之间，溃疡周围充血，主要发生在颊、唇、舌缘等部位，疼痛明显，是口腔黏膜最常见的疾病。口腔溃疡，特别是复发性口腔溃疡，常反复发作、久治不愈，给患者的工作和生活带来很大影响和痛苦[1]。目前，治疗口腔溃疡以药物治疗为主，但效果仍不够理想。

口腔溃疡女性发病率比较高，男女发病比例为1∶2.7[2]，特别是复发性口腔溃疡（Recurrent Oral Ulcer），与性激素水平有密切联系，口腔溃疡常在女性月经前和月经期反复发作，而在月经后期、妊娠期和哺乳期症状消失或好转，被认为与月经周期内性激素水平的变化有关[3-4]。有学者研究发现：女性口腔溃疡患者中的黄体期雌二醇、孕酮明显低于正常组[5-6]。月经期相关口腔溃疡患者黄体期孕酮和催乳素水平异常（催乳素升高导致孕酮分泌减少），在两者的作用下引起机体免疫功能失调，从而引起口腔溃疡周期性反复发作[7]。同时，发现口腔黏膜存在雌激素和孕激素受体分布，雌激素和孕激素刺激均可以促进黏膜修复[4，8]。为此，本研究拟通过雌激素联合孕激素对大鼠口腔溃疡模型进行干预，观察是否可以促进口腔溃疡的愈合，并对口腔溃疡的发病机制作一探讨。

1 材料与方法

1.1 材 料

雌激素（雌二醇）注射液（上海通用药业股份有限公司，批号：H31021114）；孕激素（黄体酮）注射液（上海通用药业股份有限公司，批号：151205）；成年SD 雌性大鼠40 只，体重220±20 g（上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005）；Masson 染色试剂盒（Solarbio，G1345）；HE 染色试剂盒（南京建 成 生 物 工 程 研 究 所，D006-1-1）；TGF-β1 antibody，（abcam，ab190503）；Keratin 5 antibody（abcam，ab64081）；定量PCR 检测试剂盒（南京诺唯赞生物公司，Q411-02）；总RNA 提取试剂盒（上海捷瑞生物工程公司，GK3016）；RT SuperMix 逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物公司，货号R222-01）；游标卡尺（晶思达，JSD-KC）；PCR 基因扩增仪（BIO-RAD，CFX Connect Real-Time System）；显微镜（OLYMPUS，BX43）。

1.2 动物分组

成年雌性大鼠40 只，按体重随机分为4 组，模型对照组、雌激素组（0.5 mg/mL）、孕激素组（1 mg/mL），雌激素+孕激素组。每组10 只，屏障动物实验室喂养，相对湿度60%～80%，温度22～26 ℃，常规标准大鼠颗粒饲料喂养。

1.3 模型复制方法和干预

参考文献［9］，采用改良手术方法复制大鼠口腔溃疡模型。分别以10%水合氯醛（3 mL／kg）腹腔注射麻醉后固定于操作台上，用无菌棉球干燥SD 大鼠唇侧黏膜，并用无菌棉球隔湿，将3 mm×3 mm 的NaOH 晶体置于唇侧黏膜，维持30 s 后取下NaOH 晶体，用含生理盐水的无菌棉球蘸拭处理部位，去除残余NaOH，观察记录处理部位即刻反应。模型成功标准：术后48 h，观察记录溃疡形成情况，包括形成溃疡的出现率、溃疡变化、外形是否均一规则，溃疡为中央凹陷、假膜覆盖、边缘红肿、刺激疼痛反应强烈为模型复制成功。愈合标准为黏膜上溃疡消失。

模型复制成功后，按组别设计分别进行药物干预：大鼠头部固定后，每日早晚两次，以吸管吸取药液（生理盐水稀释）滴在溃疡创面2 滴/次，模型组用生理盐水代替，持续10 d。

1.4 检测指标

1.4.1 口腔溃疡大小测量

每2 d 测量1 次，记录口腔溃疡变化情况并记录炎症、出血等改变，根据溃疡愈合组织改变绘制溃疡面积曲线和溃疡愈合率。

1.4.2 病理HE 染色和Masson 染色

第10 d 末，取口腔黏膜病变部位，10%福尔马林溶液固定后，梯度酒精脱水、石蜡包埋，切片后进行HE 染色，显微镜下观察黏膜病理改变。按Masson 染色试剂盒方法进行Masson 染色，观察胶原纤维改变。

1.4.3 组织TGF-β1、Keratin 5 免疫组化染色

免疫组化采用过氧化物酶标记法进行TGF-β1、Keratin 5 染色。石蜡切片行二甲苯梯度脱蜡，梯度酒精脱水，磷酸盐缓冲液洗3×3 min，3%H2O237 ℃孵育15 min 灭活内源性过氧化物酶，0.01 M枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中水煮10 min 进行抗原修复，滴加一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱孵育过夜，转至室温平衡30 min，磷酸盐冲洗后滴加二抗，37 ℃孵育30 min 后DAB 反应染色，苏木素复染，封片拍照。免疫组化评分采用半定量分析方法。以染色强度结合阳性细胞数百分比进行评分，染色强度以多数细胞呈现的染色强度并减去背景着色计分：无明显着色为0 分，轻微为1 分，中度为2 分，重度为3 分。阳性细胞百分比：0%～5%评为0分，6%～25%评为1 分，26%～50%评为2 分，51%～75%评为3 分，＞75%均评为4 分。最终评分以阳性细胞百分比与染色强度的加和为准：0 分为阴性，3 分为弱阳性，4～5 分为中度阳性，6～7 分为强阳性[10]。

1.4.4 Real-Time PCR 检测TGF-β1、Keratin 5 基因表达

取部分黏膜组织，液氮速冻后碾碎，使用Trizol 试剂（Invitrogen，U.S.A）提取组织总RNA，使用MMLV-reverse transcriptase 将其转化为cDNA[11]。用TGF-β1、Keratin 5 引物进行扩增，通过将阈值周期（Ct）值归一化，使用计算公式2-ΔΔCt计算出每个样本中TGF-β1、Keratin 5 的相对mRNA 量。引物序列：TGF-β1 Sense primer:′-CACCATCCATGACATGAACC-3′，Anti-sense primer:5′-TCATGTTGGACAAC TGCTC-3′；Keratin 5 Sense primer:5′ -AGG GCACCAAGACCATAAAGCA-3′，Anti-sense primer: 5′ -TTCATGTAGGCCGCGT CCAC-3′；GAPDH Sense primer: 5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，Anti-sense: primer: 5′-AGATCCACAACGG ATACATT-3′。

1.5 统计分析

采用SPSS 13.0 软件对数据进行分析，数据以mean±S.D.表示，差异性分析采用t检验或χ2检验，P＜0.05 为显著差异，P＜0.01 为极显著差异。

2 结 果

2.1 雌激素联合孕激素促进大鼠口腔溃疡愈合

模型复制第二天后，显示口腔黏膜局部出现溃疡，溃疡直径4～5 mm，周围充血红肿明显，边缘整齐，表面有灰黄色假膜覆盖（图1.A）。雌激素和孕激素干预组分别用雌二醇（0.5 mg/mL）和黄体酮（1mg/mL）每天两次局部干预溃疡部位，10 d 后，溃疡面积和溃疡愈合率的结果显示，雌二醇和黄体酮干预组口腔溃疡愈合加快（相对于模型组，P＜0.05），相对于单独给药干预组，联合干预具有良好的协同作用（相较于单独干预组，P＜0.05 或0.01）（图1.B- C）。

图1 大鼠口腔溃疡的复制和雌激素联合孕激素的干预增加溃疡愈合

2.2 雌激素联合孕激素促进溃疡模型纤维组织增加

为进一步分析雌激素和孕激素干预后对口腔溃疡模型病理的改变，运用HE 染色和Masson 染色分析病理和胶原的变化。HE 结果显示：模型组口腔黏膜表面完整性受损、表皮和角化层变化不明显、皮下组织变薄、炎细胞浸润、部分区域肌肉层显露；Masson 染色显示溃疡组织胶原纤维稀疏、紊乱。雌激素和孕激素干预后可以明显促进溃疡组织愈合，皮下组织增加，表皮和角化层增加，皮下胶原增加，炎细胞浸润减少，而联合给药明显强于单独给药组（图2）。

2.3 雌激素联合孕激素增加口腔溃疡组织TGF-β1、Keratin 5 的蛋白和基因表达

为进一步分析雌激素和孕激素对口腔溃疡组织的作用机制，通过免疫组化检测TGF-β1、Keratin 5蛋白改变，运用RT-PCR 检测其mRNA 改变。免疫结果显示：模型组口腔黏膜的TGF-β1、Keratin 5 蛋白表达较低，雌激素联合孕激素干预的皮下组织的TGF-β1、Keratin 5 蛋白表达明显增加（与模型组比较，P＜0.01），而雌激素和孕激素单独干预则不明显（图3）。为进一步研究作用机制，运用RT-PCR 去检验口腔黏膜组织的TGF-β1、Keratin 5 的mRNA 表达。溶解曲线结果显示，基因扩增产物正常，基因扩增结果统计显示模型组TGF-β1、Keratin 5 的mRNA 表达降低，而雌激素和孕激素联合干预可以增加mRNA 的表达，而单独处理组不明显（与模型组和单独处理组比较，P＜0.01）（图4）。

图3 大鼠口腔溃疡组织TGF-β1、Keratin 5 免疫组化染色

图4 大鼠口腔溃疡组织TGF-β1、Keratin 5 mRNA 表达

3 讨 论

口腔溃疡诱发的原因比较复杂，如机械性刺激、化学性灼伤、热冷刺激、遗传因素、免疫和精神因素等。有研究显示，复发性口腔溃疡与内分泌有关，部分女性患者口疮发作与月经周期有关，说明雌孕激素的水平或受体与口腔溃疡的发病有关[12]。

雌激素能够刺激阴道上皮细胞分化和角质化，增加上皮细胞内的糖原及糖原分解；孕激素促使子宫内膜从增殖期转变为分泌期，可以促进子宫内膜和乳腺上皮细胞的增生[13-14]。本研究初步显示雌孕激素对口腔溃疡具有一定的修复作用，与模型组对比，雌二醇联合黄体酮可以有效提高口腔溃疡大鼠的愈合能力，减少溃疡面积。病理结果显示雌二醇联合黄体酮改善溃疡病理改变，增加溃疡组织胶原含量，改善胶原排列，恢复溃疡组织上皮细胞排列。

TGF-β1 是由多种细胞分泌的促进细胞增殖的因子，对细胞的增殖和分化具有重要作用，在组织生长、创伤修复及细胞外基质合成中发挥重要作用[15]。本研究为进一步研究雌激素和孕激素对口腔溃疡的作用机制，通过免疫组化和PCR 对TGF-β1 的蛋白表达与基因表达进行检测，结果显示，雌二醇和黄体酮可以增加TGF-β1 mRNA 的表达，蛋白表达增加不明显。但雌二醇联合黄体酮可以明显增加蛋白和mRNA表达，提示雌激素和孕激素联合可以增加组织愈合能力与TGF-β1 信号途径有关。

角化层是上皮细胞成熟的表现标志，具有重要的功能[16]。Keratin 5 是牙龈表皮角蛋白的一种，也是上皮细胞分裂能力和成熟的重要标志[17-18]。免疫组化结果显示：Keratin 5 主要表现在口腔黏膜的细胞角化层，雌二醇和黄体酮联合可以增加Keratin 5 的表达，主要分布在上皮细胞的角化层、颗粒层和棘层，说明雌激素和孕激素可以促进口腔黏膜溃疡上皮细胞的修复和成熟。

本研究初步显示：雌二醇和黄体酮可以有效促进大鼠口腔溃疡的愈合，促进口腔黏膜上皮细胞的功能恢复和皮下胶原纤维的增殖，提示雌孕激素与口腔溃疡的发病和愈合有一定联系。但口腔溃疡的发生是否与口腔黏膜雌孕激素受体的亚型和分布有关，以及在男性口腔溃疡的发病中是否也存在内分泌异常等内容尚未涉及，需要进一步研究探讨。