黑曲霉产糠醛的培养条件优化

彭秋菊, 赵 姗, 孙 冉, 张 素, 李 祝

(贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院 山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵阳 550025)

糠醛作为一种呋喃化合物，年需求量巨大，是近十年研究最多的生物质平台化合物之一，其分子中具有呋喃环和醛基，化学性质活泼，为众多化学品的前体或衍生物[1]。以糠醛为原料直接或间接衍生出的化工产品达1 600多种, 应用涉及医药、农药、树脂、食品、香料等众多领域[2]。在农药领域，糠醛常用于多种农药合成的前体化合物，比如2-呋喃丙烯醛(杀虫剂)、环戊酮(灭菌剂)和1,4-二氧喹喔啉甲醛双腙(具有抗菌活性)等[3-5]。此外，糠醛本身还具有杀菌作用，顾振华[6]、Intisar等[7]报道了糠醛具有抑菌活性。

近年来，利用黑曲霉联合固体酸水解花生壳制备糠醛[8]，引起广泛关注，黑曲霉是一种低等真核微生物，对环境的营养要求较低，培养基中含有碳氮源、磷、钾、镁等元素就能生长良好，是一种常用的安全菌种，由于自身及其代谢产物对环境无污染、安全，且具备很多活性酶系等优点，在生物质资源化利用中有着明显的优势[9]。目前，相关文献表明黑曲霉可以作为一种生防菌株拮抗病原菌。刘超等[10]筛选出1株对稻瘟病菌具有很强抑制作用的菌株黑曲霉JS-1，彭阁等[11]从根际土壤分离出黑曲霉，对烟草黑胫病菌也具有较好的抑制效果。黑曲霉作为一种生防菌，主要来源于黑曲霉所产生的次级代谢产物对病原菌的拮抗作用。黑曲霉的代谢产物对茄病镰刀菌、根癌农杆菌和青枯雷尔氏菌等具有抑制作用[12-14]。张素等[15]与赵妗颐[16]等发现黑曲霉超临界萃取物(SE)对齐整小核菌和链格孢菌具有一定的拮抗作用，SE中5-羟甲基糠醛含量最多，但其抑菌效果并不明显，因此可以推测SE中含量较低的糠醛，具有较好的抑菌活性。

微生物产糠醛的相关报道较少，而实验室前期发现糠醛为黑曲霉的主要抑菌物质之一并建立了测定方法，但测定的含量较低[17]。为稳定黑曲霉产糠醛的培养体系，本次实验通过响应面分析法(RSM)优化培养条件。响应面分析法是一种较好的试验设计方法，被广泛应用于培养基和培养条件的优化中[18]。本研究旨在通过响应面分析法优化黑曲霉产糠醛的培养条件，为利用最佳的培养基条件优化黑曲霉产糠醛的含量提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与培养基

黑曲霉(Aspergillusniger)xj：来源于李祝等[19]首次从果树根系土壤中分离得到，现保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCC编号：M206021，专利公开号：CN 1847388。

PDA固体培养基：葡萄糖20 g/L，马铃薯200 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌30 min。

PDB液体培养基：葡萄糖20 g/L，马铃薯200 g/L，pH 7.0，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌30 min。

1.1.2 试剂

1 g/L吐温-80：吸取0.1 g吐温-80于99 mL蒸馏水中，得到0.1%吐温-80工作液。

体积分数为50%的乙醇：分别量取等量的无水乙醇和蒸馏水混合，摇匀备用。

1.2 方法

1.2.1 制备孢子悬浮液

将活化的黑曲霉接种于PDA平板上，26 ℃培养7 d后无菌条件下利用1 g/L 吐温-80溶液冲洗孢子并过滤制备孢子悬浮液。参照袁洪威等[20]用分光光度法测定黑曲霉孢子浓度的方法对孢子计数后置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 高效液相色谱法测定黑曲霉发酵液中糠醛的含量

参照张素等[17,21]利用HPLC测定黑曲霉产糠醛的含量。具体步骤：将斜面试管保藏好的黑曲霉，活化之后制成均一孢子悬液，将孢子悬液以体积分数为8%～12%接种于发酵瓶中培养7 d，10 000 r/min离心15 min取上清液。将上清液用300 mL乙醚萃取(分2次进行，萃取后得到200 mL乙醚)，自然挥干乙醚，再用6 mL甲醇溶解后12 000 r/min离心2 min取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。色谱条件：Spheriorb C18色谱柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm)，以乙睛∶0.1%乙酸水 (冰乙酸调) =10∶90 (体积比)为流动相，柱温30 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长λ=277 nm。

1.2.3 糠醛标准曲线的制作

参照张素等[17]利用HPLC测定黑曲霉菌丝体中糠醛含量。略微进行修改：称取糠醛标准品1 mg，制成质量浓度为1 mg/mL的标准溶液。将其稀释成为质量浓度为1、5、10、20和40 μg/mL，用上述条件进行测定。横坐标为质量浓度 (x，μg/mL)，纵坐标为峰面积 (y)。

1.2.4 培养基优化

单因素试验主要以淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇为碳源，浓度设置为10、20、40、60和80 g/L；以硝酸钠、硝酸钾、尿素、亚硝酸钠、硫酸铵为氮源，浓度设置为0.5、1、2、3和5 g/L；pH值设置为3、5、7、9和11；温度设置为18 ℃、22 ℃、26 ℃、30 ℃和34 ℃；转数设置为90、120、150、180和210 r/min等5个变量考察各个因素对黑曲霉发酵液产糠醛含量的影响。

1.2.5 响应面分析法优化培养条件

(1)Plackett-Burman(PB)正交设计。采用Minitab 17 软件中的 Plackett-Burman设计法，对碳源、氮源、pH值、温度、转数等5个因素进行试验设计，以各个因素的正效应高、负效应低(-1)两个水平进行筛选，筛选出对黑曲霉发酵液中糠醛含量作用显著的因素(表1)。

表1 PB试验因素及水平Table1 PB experimental factors and levels

(2)最陡爬坡试验。根据PB试验结果确定最陡爬坡的方向与步长。分别以葡萄糖40 g/L、尿素2 g/L、pH值7 等3个因素为最陡爬坡初始值，步长分别为15、0.5 和0.5 g/L，试验设计细节如表2。

表2 黑曲霉产糠醛的最陡爬坡设计方案Table 2 Design scheme of steepest climb for furfural production by A. niger

(3) 响应面分析法。根据最陡爬坡试验结果，选取对黑曲霉产糠醛影响较为显著的葡萄糖浓度、尿素浓度、pH值等3个因素，以黑曲霉产糠醛的产量为响应值，建立三因素三水平的试验设计(表3)。

表3 Box-Behnken试验因素与水平Table 3 Box-Behnken experimental factors and levels

2 结果与分析

2.1 标准曲线

利用HPLC制得的糠醛标准曲线如图1可知，糠醛标准曲线线性回归方程为y=61.57x+79.732(R2=0.999)，糠醛质量浓度的线性范围0～40 μg/mL之间呈良好的线性关系，满足样品测试要求。

图1 糠醛HPLC标准曲线Figure 1 HPLC standard curve of furfaral

2.2 单因素优化试验

由图2(a)可知，在不同的碳源下黑曲霉产糠醛的量不同，在添加的5种碳源中，葡萄糖为唯一碳源时，黑曲霉产糠醛的量最大，故选择葡萄糖作为最优碳源。选取葡萄糖浓度为10、20、40、60和80 g/L进行试验，发现当浓度为40、60和80 g/L，黑曲霉提高产糠醛的能力明显增大，分别达到2.88、2.85 和2.88 μg/mL[图2(b)]。由图2(c)可知，不同氮源对黑曲霉产糠醛的影响结果表明，5种氮源都可以被利用，但利用的能力存在着明显不同。以尿素为氮源时，黑曲霉产糠醛含量影响最大(3.28 μg/mL)，选取尿素浓度为0.5、1、2、3、5 g/L进行试验，当浓度为3 g/L，黑曲霉产糠醛产量最高，含量为3.78 μg/mL[图2(d)]。微生物只有在适宜pH条件下才能良好生长，当培养基初始pH为中性(pH 7)时，黑曲霉产糠醛的量较高，含量为3.7 μg/mL [图2(e)]。当培养温度为26 ℃时糠醛含量为3.92 μg/mL，随着培养温度的升高，发酵液中糠醛含量开始减少，34 ℃时降到0.62 μg/mL，因此确定黑曲霉产糠醛的最适温度为26 ℃[图2(f)]。在培养过程中，摇瓶转速是为了给微生物提供氧量，转速过高或过低都不利微生物的生长，当转数在150 r/min左右时，黑曲霉产糠醛含量较高，为3.91 μg/mL[图2(g)]。

不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。图2 单因素优化试验结果Figure 2 Experimental results of by single-factor optimization

2.3 PB设计结果

根据PB设计试验所得的数据，用Minitab17.0软件分析得出对应的一阶回归方程：

y=2.440+0.372A+0.409B+0.552C-

0.005D+0.045E

试验设计及结果如表4，各因素对响应值Y的影响效果分析如表5，存在3个变量的P值小于0.05[葡萄糖(A)、尿素(B)和初始pH值(C)]，表明它们对糠醛产量影响显著。2个变量的P值大于0.05[温度(D)、转速(E)]，表示它们对糠醛产量影响不显著。

表4 PB试验设计方案及结果Table 4 PB experimental design scheme and results

表5 回归方程的变量分析Table 5 Variable analysis of regression equation

因此选用葡萄糖(A)、蔗糖(B)、初始pH值(C)等3个因素做进一步的最陡爬坡试验。

2.4 最陡爬坡试验优化

选定葡萄糖(A)、尿素(B)、pH值(C)等3个因素为自变量，以黑曲霉产糠醛含量为响应值，设计最陡爬坡试验。其试验结果如表6所示。即以葡萄糖浓度70 g/L、尿素浓度3 g/L、初始pH值8为组合中心点进行响应面分析。

表6 黑曲霉产糠醛的最陡爬坡设计及结果Table 6 Design and results of steepest ascent for furfural production by A. niger

2.5 响应面设计优化

2.5.1 响应模型的建立与分析

在PB试验、最陡爬坡试验基础上，用中心组合设计进行进一步的优化。以黑曲霉产糠醛含量为响应值，用Minitab17.0软件设计出三因素三水平的Box-Behnken试验，试验结果如表7，对表7中数据进行多元回归拟合，得到以黑曲霉产糠醛含量(y)为响应值的二次多项式回归方程：

y=3.925+0.217A+0.113B+0.099C-0.128A2-

0.374B2-0.077C2-0.094AB+0.112AC+0.090BC

其中，y为响应值(黑曲霉产糠醛含量)；A、B、C分别代表葡萄糖、尿素、pH值。各因素对黑曲霉发酵液中糠醛含量的方差分析如表8，F值分析结果表明：葡萄糖、尿素和pH值等3个要素的影响极显著(P<0.01)。

表7 黑曲霉产糠醛的响应面结果Table 7 Response surface results of furfural production by A. niger

表8 Box-Behnken 试验设计回归分析结果Table 8 Regression analysis of experimental results based on Box-Behnken design

2.5.2 响应面分析

利用Minitab17.0软件对表8中的数据进行二次多元回归拟合。响应面图和等高线图能直接反映出各因素间对黑曲霉产糠醛含量的交互作用情况，响应面坡度越陡峭，表明因素作用越显著。由图3可知，葡萄糖与尿素、pH与葡萄糖以及尿素与pH的相互作用较显著，由等高线分析可知，3个因素对黑曲霉产糠醛含量的影响呈现：葡萄糖>尿素>pH。

(a)葡萄糖; (b)尿素;(c)pH值。Y: 糠醛含量/(μg/ mL)。图3 葡萄糖与尿素、pH与葡萄糖和尿素与pH的响应面与等高线图Figure 3 Response surface and contour plot of glucose and urea, pH and glucose and urea and pH

2.5.3 确定最佳培养条件与验证回归模型

对数学模型进行分析，得到最优培养条件为葡萄糖80 g/L、尿素3.03 g/L、pH值8.2。发酵液中糠醛含量预测最大值为4.156 μg/mL。用响应面分析所得的最优培养条件结合单因素试验得到的优化条件进行验证，得到糠醛含量的3次试验平均值为4.094 μg/mL，和预测的理论值只相差0.06 μg/mL，结果可靠。

3 讨论与结论

微生物产生的代谢产物其生成效率与黑曲霉菌株自身特性相关，也受培养条件的影响，因此培养基营养成分及条件对黑曲霉产糠醛是非常重要的。李丽等[22]采用单因子实验研究碳源、氮源、初始pH值、温度和转速等因子对解淀粉芽孢杆菌M1产芽孢量的影响。邓雪萍[23]利用碳源、氮源、初始pH值、温度和摇瓶转速等因子对枯草芽孢杆菌EF-B01菌株进行发酵条件的优化。说明碳源、氮源、pH值、温度及摇瓶转速是进行培养的常见要素。本研究利用单因素试验对这5种要素进行评估。5种碳源中，黑曲霉产糠醛最有效的碳源是葡萄糖，能够有效促进黑曲霉的生长，分析原因可能是葡萄糖是一种速效碳源，有助于菌体的生长繁殖。这与Dyal等[24]的发现被孢霉菌株也是较容易利用单糖一致。5种氮源中，尿素对黑曲霉产糠醛含量影响最佳，尿素作为常见氮源，可为微生物的生长提供更利于吸收利用的营养成分[25]。此外，王福荣[26]和白爱枝等[27]发现培养基中pH值、培养温度和摇瓶转速对微生物的生长繁殖和代谢产物的积累有重要影响，是培养过程中控制优化的重要参数。因此本次试验考察碳源、氮源、pH值、温度和摇瓶转速对黑曲霉产糠醛的条件，为黑曲霉产抗菌物质的培养条件奠定基础。

传统的数理统计方法包括线性回归分析和正交试验设计，它们虽已广泛应用于工农业生产和科学研究，但仍存在一些缺点，而响应面分析方法在很大程度上弥补了这两种方法的不足[28-29]。目前，已有报道利用响应面分析法优化黑曲霉产代谢物的条件。李祝等[30]采用响应面法优化黑曲霉xj产抗菌物质的培养基条件，优化后的发酵液抗菌活性提高了83%；魏宝东等[31]利用响应面法优化黑曲霉代谢产物诱导子的诱导条件来产纳他霉素，优化后其产量提高了1.68倍；冯培勇等[32]利用响应面法对黑曲霉产纤维素酶的发酵条件进行优化，优化后纤维素酶活力提高34.4%。以上都说明利用响应面法进行优化，能不同程度地提高产物的活性及产量。而在本研究中，通过响应面法优化黑曲霉产糠醛的培养条件，最优培养条件为葡萄糖80 g/L、尿素3.03 g/L、pH 8.2、温度26 ℃、转速150 r/min，培养3 d后黑曲霉发酵液中糠醛含量达到4.094 μg/mL，较优化前提高20.2%。优化后的含量值不高，原因可能是糠醛作为黑曲霉所产生的次级代谢产物，且本身具有抑菌作用，优化后含量过高会对黑曲霉本身产生不利的影响。该结果表明在不影响黑曲霉本身的情况下对糠醛进行优化，可建立一种良好的培养条件体系，同时丰富了糠醛作为抑菌活性物质的相关报道，为防治植物病害方面奠定基础。