“天然植物抗菌液”(PAMs)潜在抗SARS-CoV-2活性成分及机制

杨 蕾， 敖智广， 项 坤， 何佳萌， 常 苗， 李 栋， 茆灿泉

(西南交通大学生命科学与工程学院四川省天然药物仿生合成工程研究中心， 成都610031)

在抗击新冠肺炎(COVID-19)疫情的全过程中，中医药全面、深度参与，从预防、治疗到康复的全环节发挥了不可替代的重要作用[1]。我国各省市已广泛开展中医药治疗COVID-19的研究，并逐渐形成各自地方特色的治疗方案。天然植物抗菌液(Natural plant antimicrobial solutions，PAMs)是由云南普洱丹州制药股份有限公司研发的从多种传统中草药中提取制备的一种复方产品。2015年，其升级产品“紫云解毒止痛酊”获云南省食品药品管理局批准为医院制剂(滇药制字Z20150009)。前期研究表明，PAMs具有抗菌消炎、止痛、促进创口愈合等多种生物学功效[2-4]。

网络药理学强调对信号通路的多途径-多成分-多靶点的全面调控，从分子和生物学的角度将中药的有效成分与疾病的靶点相联系，为中药药理药效提供了一定的物质基础支撑[5]。本研究期待通过PAMs作用于SARS-CoV-2的网络药理学与分子对接探究，并结合其抗M13噬菌体病毒的作用测定结果，初步推断PAMs潜在抗新型冠状病毒的物质基础及机制，为PAMs在抗COVID-19中的可能应用提供重要的理论依据与参考。

1 材料与方法

1.1 PAMs化学成分收集

通过TCMSP、BATMAN、YaTCM数据库检索PAMs复方5种药材(红花、紫草、艾纳香、芸香草、刺天茄)所含的化合物，在TCMSP和YaTCM数据库中设定类药性(Drug-Likeness，DL)DL ≥0.18，BATMAN数据库中设定Score≥20，对PAMs的活性成分进行筛选。

1.2 药物靶点预测

成分筛选结束后，收集成分的预测靶点信息并统一在Uniprot蛋白数据库进行规范化整理。

1.3 疾病靶点预测

使用GeneCards数据库以冠状病毒“coronavirus”、肺炎“pneumonia”为关键词分别进行检索，获得疾病的相关靶点。

1.4 潜在作用靶点的获取

分别将药物靶点、冠状病毒疾病靶点以及疾病靶点导入Venny 2.1在线作图工具平台，对三者取交集，绘制韦恩图，作为PAMs的潜在作用靶点。

1.5 中药复方调控网络的构建

将药物潜在作用靶点及其所对应的化合物导入Cytoscape软件，构建药材-成分-靶点-疾病网络调控图，并对各个节点度的大小进行分析。

1.6 PPI网络的构建与分析

将药物潜在作用靶点导入Cytoscape软件的Bisogenet插件，构建蛋白质互作网络。使用Cytoscape软件的cytoNCA对PPI网络进行拓扑结构分析。

1.7 GO和KEGG富集分析

使用R语言对潜在作用靶点进行富集分析，分别选取富集结果的前20名，绘制得到柱状图和气泡图。使用Cytoscape软件构建KEGG关系调控网络。

1.8 分子对接

在PDB数据库中下载Mpro(PDB ID：6LU7)、ACE2(PDB ID：1R42)以及S刺突糖蛋白(PDB ID：5WGR)的3D结构图。从Pubchem获取PAMs主要活性成分槲皮素(CID：5280343)、芹菜素(CID：5280443)、熊果酸(CID：64945)、木犀草素(CID：5280445)、山奈酚(CID：5280863)、杨梅素(CID：5281672)以及黄芩素(CID：5281605)的2-D结构。选取洛匹那韦(CID：92727)、利巴韦林(CID：37542)、瑞德西韦(CID：12304016)、阿奇霉素(CID：447043)以及硫酸羟基氯喹(CID：12947)作为阳性对照。将各药物分子及受体蛋白结构导入AutoDock Tools进行去水、加氢、平衡电荷等预处理；将处理后的文件输入PyRx软件，采用vina模块进行半柔性分子对接，计算次数设置为9次，其余参数为默认。选取每个药物分组与受体蛋白结合最低的一组，使用PyMOL软件对对接结果进行可视化。

1.9 PAMs对M13噬菌体的抑制作用

挑取噬菌体单克隆，扩增，将其滴度调整至1.0×1010pfu/μL。使用LB液体培养基稀释PAMs，使其终浓度为4.0%～20.0%；同时设置LB空白对照组、食用酒精对照组(浓度为2.0%～10.0%)。取1.0 μL稀释好的噬菌体液分别与200.0 μL实验组、空白组、酒精对照组混合，作用4 h，4 ℃轻微振荡。测定作用结束后的噬菌体滴度，计算PAMs对噬菌体的抑制作用(IR)，公式为IR=(1-N/N0)×100%

式中，N为酒精处理后噬菌体的滴度；N0为投入噬菌体滴度。

2 结果与分析

2.1 PAMs活性成分及靶点获取

通过数据库检索，共得到PAMs中活性成分166个，其中花生酸、咖啡酸、槲皮素、油酸、棕榈酸和硬脂酸为多种药材共同含有。对各个数据库预测的靶点去重后，一共得到药物靶点1 007个。

表1 药材-成分-靶点信息总结

2.2 疾病靶点及药物潜在作用靶点获取

通过GeneCards数据库共得到与冠状病毒相关的基因351个，与肺炎相关的基因4 575个。对疾病靶点和药物靶点三者取交集，共得到73个PAMs潜在作用靶点(图1)。

图1 PAMs与冠状病毒靶点交集韦恩图Figure 1 Venn diagram of the intersection of PAMs andCoronavirus targets

2.3 药材-成分-靶点-疾病调控网络

将73个潜在作用靶点输入Cytoscape软件，构建中药复方调控网络(图2)。该调控网络包括186个节点(其中5种药材，108个化合物，73个基因)，511条边。结果采用度值进行排序，槲皮素、芹菜素、熊果酸、木犀草素、山奈酚、杨梅素、黄芩素、油酸、水杨酸等9个化学物均能与10个以上的靶点相结合，推测其可能为PAMs抗新型冠状病毒的关键成分。PTGS2、PTGS1、PPARG、DPP4、CALM1、CASP3、PELA、BAX等8个基因的度数均>10，推测其可能是PAMs抗SARS-CoV-2的关键作用基因靶点。

2.4 PPI互作网络构建

将73个潜在药物作用靶点导入Bisogenet软件，得到PPI网络关系数据(图3)。该原始网络共包含4256个节点，99 375条边，节点度中位数为26。根据节点度中位数2倍(DC≥52)进行筛选，得到子网络(b)。子网络(b)共有1 118个节点，介度中心度中位数为406，根据介度中心度的中位数2倍(BC≥812)进行筛选，得到子网络(d)。子网络(d)共有316个节点，紧密中心度中位数为0.56，根据CC≥0.56过滤，得到子网络(c)。子网络(c)共有158个节点，其中NTRK1、RELA、RB1、CDK2、RNF2、 EGFR、TP53、AR、FUS等靶点蛋白排名靠前，推测可能为PAMs的重要作用靶点。

ANX、HH、CTQ、ZC、YXC分别代表艾纳香、红花、刺天茄、紫草、芸香草。图2 药材-成分-靶点-疾病调控网络图Figure 2 Network for medicinal plant-ingredient-target-diseaseregulation

(a)PAMs抗冠状病毒潜在靶点的蛋白互作网络；(b)根据DC≥52，从(a)中提取关键蛋白创建的子网络；(d)根据BC≥812，从(b)中提取关键蛋白创建的子网络；(c)根据CC≥0.56，从(d)中提取关键蛋白创建的子网络。图3 PAMs与潜在蛋白靶点的PPI互作网络Figure 3 PPI interaction network between PAMs and potentialprotein targets

2.5 GO和KEGG富集分析

73个潜在药物靶点经过R软件运行后，共得到GO富集分析(P<0.05)2 109个条目，其中包括1 952个生物学过程(Biological process，BP)、50个细胞组分(Cell component，CC)和107个分子功能(Molecular function，MF)。生物学过程主要与脂多糖反应、细胞因子生成的正调控、细胞对生物刺激的反应等相关；细胞组分主要涉及转录因子复合体、核孔复合体、线粒体等；分子功能主要集中在与细胞因子受体、生长因子受体以及蛋白磷酸酶等的结合[图4(a)(b)(c)]。KEGG富集分析共得到144条信号通路，其中人巨细胞病毒感染、TNF、甲型流感信号通路、IL-17信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒信号通路等被显著富集[图4(d)]。使用Cytoscape构建KEGG调控网络通路，该调控网络共有69个节点(20个信号通路、49个基因)，359条边。节点的大小与节点度数成正比(图5)，与炎症、病毒相关信号通路在PAMs抗冠状病毒及肺炎中可能起着关键调控作用，RELA、 MAPK1、NFCCL2、MAPK14、CASP3、TNF等为调控网络中的关键靶点。

(a)生物过程；(b) 细胞组分；(c)分子功能；(d)KEGG富集分析。图4 GO和KEGG富集分析Figure 4 GO and KEGG enrichment analysis

图5 基因-信号通路网络调控图Figure 5 Regulation network for gene and signaling pathway

2.6 PAMs主要成分与SARS-CoV-2相关蛋白的分子对接

将PDB数据库中最新解析的SARS-CoV-2关键蛋白Mpro、S刺突糖蛋白以及受体蛋白ACE2的3-D结构作为蛋白受体分子，将药材复方调控网络中化合物度数排名前7的化合物以及几种对照药物作为配体与之对接，结果如表2所示。根据结合能大小判断结合能力强弱，PAMs中排名前3的化合物与受体蛋白的结合模式图(图6)。

2.7 PAMs抗M13噬菌体作用

PAMs对M13噬菌体的影响由图7可知，随着PAMs浓度增加，抑制率也随之上升。PAMs浓度为4.0%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%时，抑制率均值分别为36.3%、39.5%、63.2%、70.0%、99.1%。

表2 PAMs主要成分与SARS-CoV-2关键靶标蛋白的分子对接结果

(a)(b)(c) 槲皮素、黄芩素以及杨梅素与AEC2分子对接；(d)(e)(f)槲皮素、黄芩素以及木犀草素与Mpro分子对接；(g)(h)(i)槲皮素、黄芩素以及木犀草素与S刺突糖蛋白分子对接。图6 PAMs主要核心成分与新冠病毒关键蛋白分子对接Figure 6 Molecular docking of the main active components of PAMsto the keyproteins of SARS-CoV-2

图7 PAMs对M13噬菌体的抑制作用Figure 7 Inhibitory effects of PAMs for M13 phages

3 讨论

本研究通过网络药理学方法，共检索到PAMs潜在的活性化合物166个，主要来源于红花和紫草两种药材，并实验测定了PAMs对M13噬菌体病毒的抑制作用。前期本实验室对PAMs的研究显示，其可有效调控TNF-α和NF-κB信号通路，下调IL-6、IL-8等炎症因子，具有显著的消炎抗菌效果[3]。研究报道，TNF-α、IL-6、IL-8等可以促进VEGF的表达，导致患者肺部炎症的加剧[6]。PAMs在COVID-19防治中可能具有激活免疫、抗菌消炎以及抗病毒的作用。同时PAMs的多重功效，对合并有基础病的患者，可以起到综合防治的辅助作用。

Mpro在病毒的蛋白酶切过程中发挥着重要作用，抑制Mpro可以有效阻断病毒的复制[7]。ACE2是严重急性呼吸综合征(SARS)病毒(SARS-CoV)以及SARS-CoV-2的人宿主细胞受体，SARS-CoV-2通过其表达的S刺突糖蛋白与人体ACE2结合，从而导致病毒侵入人体[8]。研究显示通过冷冻电镜技术，发现SARS-CoV-2的S刺突糖蛋白与ACE2的亲和力是SARS病毒的10～20倍，推测其可能是SARS-CoV-2高传染率的真凶[9]。通过网络药理学分析可知，槲皮素、芹菜素、熊果酸、木犀草素、山奈酚、杨梅素、黄芩素、油酸以及水杨酸可能为PAMs抗冠状病毒及肺炎的关键活性成分。在随后的KEGG富集分析过程中，我们发现除TNF、IL-17等炎症相关信号通路被显著富集外，不少与病毒感染的信号通路也被显著富集，如人巨细胞病毒、甲型流感、疱疹病毒感染信号通路。PAMs可通过调节这些病毒感染引起的自身免疫反应而降低机体炎症反应。

本研究也通过构建信号通路-基因调控网络，探究了PAMs与COVID-19可能作用的核心靶点。按照节点自由度排序，RELA、NF-κB1、MAKP1、TNF、IL-6、MAPK14、STAT1、CASP8、JAK1、FOS、CASP3、IFN-β1、TGF-β1节点度数均>10，被认为是PAMs的核心靶点。RELA属于NF-κB家族成员，TNF、IL-6、COX-2等都可以激活NF-κB信号通路，从而在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中起着关键调控作用[10]。PAMs有望通过作用于这些核心靶基因，抑制炎症和激活免疫相关通路，从而在COVID-19的防治中发挥作用。

将PAMs核心成分以及目前临床推荐的化学药物分别与Mpro、ACE2、S刺突糖蛋白进行AutoDock vina分子对接。结果表明，槲皮素、黄芩素和木犀草素与Mpro、ACE2以及S刺突糖蛋白均有较好的结合能力，其结合能绝对值略高于洛匹那韦、瑞德西韦和阿奇霉素，远低于利巴韦林和硫酸羟基氯喹。研究报道，黄芩苷及其苷元黄芩素体内给药一般可以减轻组织炎症性损伤，下调模型动物血浆促炎细胞因子水平(TNF-α、IL-1、IL-6等)，并可以调节某些免疫细胞分泌细胞因子[11]。木犀草素不仅能够抑制巨噬细胞磷酸化，进而抑制转录因子NF-κB的活性，还能够抑制LPS诱导的巨噬细胞产生细胞因子IL-6、TNF-α，降低机体炎症反应[12-13]。此外，槲皮素和木犀草素还可以抑制SARS病毒S刺突糖蛋白的活性，阻止病毒进入宿主细胞，直接清除病毒[14]。

综上所述，本研究从分子水平揭示了PAMs多成分、多靶点、多通路的特点，为PAMs潜在抗新型冠状病毒潜在应用提供了前期理论数据支持。PAMs复方中红花、紫草的关键功效成分槲皮素、黄芩素以及木犀草素可能是PAMs抗病毒的主要药效成分，可能通过调节细胞免疫、降低炎症反应等多通路和多靶点作用于COVID-19。本研究存在一定的不足，一方面，考虑到PAMs主要是通过外用给药途径，研究中仅通过药代动力学中类药性(DL≥0.18)一个条件进行了筛选；另一方面，鉴于SARS-CoV-2属于新发现的冠状病毒，在网络药理学研究中，我们仅能收集到冠状病毒和肺炎的交集基因，将其作为SARS-CoV-2的可能作用靶点，存在一定的局限；同时，我们仅采用了AutoDock vina一种分子对接软件分析，其结果准确度尚需通过其他分子对接软件及在更高次数与步数等参数条件设置下进行验证；再者，鉴于我们实验室条件的限制，我们仅以M13噬菌体这种简单、易操作和安全的细菌病毒作为靶标，开展PAMs的抗病毒抑制测定，其与冠状病毒、SARS-CoV-2无论从病毒进化与分类、还是宿主，均存在很大的差异，其噬菌体模型有着很大的局限，后期还需要通过抗SARS-CoV-2以及临床试验及应用等进一步的实验验证与支持。