一株自生固氮菌的筛选、鉴定及生长条件优化

汪蕊露， 李 进， 王 翀， 刘虎虎， 卢向阳， 田 云

(湖南农业大学生物科学技术学院， 长沙410128)

氮素作为有机分子的重要组成元素，生物体的生长代谢都离不开它的参与。植物从土壤中吸收大量的氮素以维持生命活动，而土壤中的氮素含量是衡量土壤生产力大小的主要影响因子[1]，为平衡土壤中氮素流失、提高生产力，需进行固氮作用，固氮的主要方式有天然固氮、工业固氮以及生物固氮，其中生物固氮主要是利用固氮微生物中的酶系统将空气中的氮气变成氨的作用，生物固氮相比于人工固氮和天然固氮来说更广泛，自然界中主要依靠生物进行固氮，这种方式对生态系统的氮素循环产生重要的作用。

固氮细菌从生物固氮形式来分主要有3大类：联合固氮菌、共生固氮菌以及自生固氮菌。联合固氮菌因不能与宿主生物体形成特定的固氮共生结构，所以易受病虫害等生物逆境以及干旱等非生物逆境影响，固氮效率较低[2]；共生固氮菌宿主特异性强，只与特定的豆科植物形成根瘤，作用对象较为单一[3]；自生固氮菌固氮效率较低，且当氮源满足自身代谢需求后，剩余氮源便会抑制固氮菌活性，但自生固氮菌分布广且适应能力强，即使在营养匮乏的土壤中也能生存并进行固氮。自生固氮菌可通过体内酶系统进行催化反应，将生成的氮素营养物质供给植物利用，因此可显著提高农作物产量。有研究发现自生固氮菌具有产植物激素的功能，对植物的生长代谢有重要作用[4]，另外还能产有机酸，可显著降低土壤中无效钾的含量[5]，因此自生固氮菌广泛应用于固氮菌剂中，在取代氮肥的应用上拥有广阔前景，同时也将对我国农业发展产生重大影响[6]。

本研究从多地采样筛选出稳定性好且适应能力强的自生固氮菌并对其进行特性研究，从而为生产应用中的固氮菌剂提供更为丰富的固氮菌资源，现阶段高效自生固氮菌的筛选已成为农业应用的基础，对农业生产发展至关重要。

1 材料与方法

1.1 材料来源

本试验所用的材料是2017年12月在湖南长沙、湖南岳阳、山西朔州、浙江宁波、江苏南京、河南洛阳等地植物根际以及淤泥土壤约15～20 cm深处采集的土样(表1)，采样量约为1 000 g，各2份，一份样品放入4℃冰箱保存，另一份样品进行试验。

表1 采样统计表

1.2 培养基

无氮培养基、LB培养基参考文献[7]配制，生理生化鉴定培养基参考《常见细菌系统鉴定手册》[8]配制。

1.3 自生固氮菌的筛选

将选取的土样分别称取适量样品并倒入无菌水，搅拌均匀后放入30 ℃，180 r/min的摇床中振荡培养30 min，采用梯度稀释法将培养液稀释成10-2、10-3、10-4、10-5以及10-2(煮沸10 min)、10-3(煮沸10 min)的悬浮液，将不同浓度悬浮液在以蔗糖为唯一碳源的固体无氮培养基上进行涂布，经多次平板划线进一步纯化、分离得到单菌落。

利用乙炔还原法，在装有液体无氮培养基的血清瓶中接种菌株并打入乙炔，培养1 d后吸取0.1 mL瓶中气体打至气相色谱仪中得到乙烯峰面积，采用考马斯亮蓝法测定菌体蛋白浓度，通过固氮酶活性计算公式得出菌株的固氮酶活性。

固氮酶活性=(瓶子上方体积×所测菌株乙烯峰面积)/(1 nmol乙烯峰面积×瓶内气体体积×菌体蛋白×反应时间)

1.4 自生固氮菌的鉴定

1.4.1 形态学观察及生理生化鉴定

肉眼观察菌落的形态特征；生理生化依据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定[8]。

1.4.2 16S rDNA序列鉴定

运用基因组DNA抽提试剂盒采用磁珠法对菌株总基因组DNA进行提取，之后使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)对16S rDNA序列进行扩增[9]，反应体系如表2所示，PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃再延伸10 min。反应结束后对产物进行纯化回收。最后将连接产物转到感受态细胞中并送去测序，送回的序列使用NCBI进行序列比对并使用Mega 7.0软件构建系统发育树，结合形态学观察、生理生化鉴定结果对所筛菌株的种属进行确定。

表2 PCR扩增反应体系

1.5 生长条件的优化

通过碳源、氮源、初始pH、温度、转速和蔗糖浓度等单因素生长优化的试验结果，结合Box-Behnken设计的原则，最终确定3个因素以A(蔗糖浓度)、B(转速)、C(温度)表示，以波长600 nm处菌液的吸光值(Y)为考察指标，进行三因素三水平的响应面试验[10]，其中中水平为单因素试验结果中的最佳条件，也称为0水平[11]，试验设计中所用的因素与水平见表3。

表3 菌株C-5-2生长条件优化响应面试验因素与水平

1.6 数据处理

单因素试验应用Excel软件进行数据分析，响应面试验使用Design-Expert软件进行二次多元回归拟合及方差分析检验。

2 结果与分析

2.1 自生固氮菌的筛选

从湖南长沙、湖南岳阳、山西朔州、浙江宁波、江苏南京、河南洛阳植物根际或淤泥土壤采集10份土样，进行富集培养后，利用稀释浓度梯度法以及平板划线法进行固氮菌的分离与筛选，最终得到500多株单菌，进一步将分离得到的菌株接种至液体无氮培养基中，得到可生长的菌株93株，其中有株具有固氮酶活性，分别编号为C-5-2、A-5-11、HQ-5，试验结果表明从山西省朔州市玉米根际土壤筛选出的自生固氮菌C-5-2具有更高的固氮酶活性，达到140.14 nmol C2H4/mg.protein.hr。

2.2 自生固氮菌C-5-2的鉴定

固氮菌C-5-2的菌株形态如图1所示，革兰氏染色显微镜观察如图2所示，表4为菌株形态以及生理生化特征结果。进一步对16S rDNA测序结果进行BLAST比对，构建16S rDNA序列系统进化树(图3)，对菌株序列进行比对发现菌株C-5-2与Azotobacter-chroococcumATCC 9043T以及Azotobacterchroococ-cumsubsp.ChroococcumIAM 12666T的相似性都达到99%，综合形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列系统进化树分析结果表明：菌株C-5-2鉴定为Azotobacter属，命名为Azotobactersp. strain C-5-2。

图1 C-5-2菌株形态平板图Figure 1 Morphological plate map of strain C-5-2

图2 菌株C-5-2革兰氏染色显微镜观察Figure 2 Microscopic observation of strain C-5-2 with Gram stain

表4 菌株的形态与生理生化特征Table 4 Morphological and physiological and biochemicalcharacteristics of the strain

图3 菌株C-5-216S rDNA系统发育树Figure 3 16S rDNA phylogenetic tree of strain C-5-2

2.3 生长条件的优化

2.3.1 单因素优化

由图4(a)所示碳源的利用情况可看出可溶性淀粉、乳糖以及蔗糖中固氮菌的生长速度较快，另外肉眼观察到在这几种碳源下培养后的菌株菌体形态良好，实际研究过程考虑成本等各方面因素选用蔗糖进行试验；氮源的利用情况如图4(b)所示，在无氮、牛肉膏以及酵母提取物中生长情况良好，在实际试验过程考虑各方面因素选用无氮条件进行研究。如图4(c)所示，菌株C-5-2在初始pH 9.0的条件下呈现较好的生长态势，且初始pH 9.0与10.0的条件下的生长情况相似，另外对菌株C-5-2在碱性环境下培养后的溶液pH进行测定，发现溶液pH呈中性；如图4(d)所示，菌株在温度为30 ℃的条件下生长最佳，且在35 ℃时同样可促进菌株生长；如图4(e)所示，转速在150 r/min时，菌株生长的速度最快且菌株生长情况最佳，转速为200 r/min时同样有利于菌株的生长，而转速低于100 r/min时则会抑制菌株生长；如图4(f)所示，蔗糖浓度在10 g/L时菌株生长情况最佳，在15 g/L的蔗糖浓度下也表现出良好的生长状态，随着蔗糖浓度的升高对菌株生长具有明显的抑制作用。

(a)碳源对菌株C-5-2生长条件的优化结果；(b)氮源对菌株C-5-2生长条件的优化结果；(c)pH对菌株C-5-2生长条件的优化结果；(d)温度对菌株C-5-2生长条件的优化结果；(e)转速对菌株C-5-2生长条件的优化结果；(f)蔗糖浓度对菌株C-5-2生长条件的优化结果。图4 单因素生长条件的优化Figure 4 Optimization of single factor growth conditions

综上所述，自生固氮菌C-5-2的单因素生长条件确定为初始pH 9.0、温度30 ℃、转速150 r/min、蔗糖浓度10 g/L且在无氮条件下。

2.3.2 响应面优化

(1)影响Azotobactersp.strain C-5-2生长的主要因素分析。使用Design-Expert软件进行二次多元回归拟合，得到蔗糖浓度(g/L)、转速(r/min)以及温度(℃)与Azotobactersp.strain C-5-2培养后的OD600的二次多项回归方程：

Y=1.32+0.023A-0.059B+0.31C+0.035AB-0.083AC+0.11BC-0.11A2-0.14B2-0.35C2

对以上试验结果进行方差分析，由表5可知，模型P<0.05，表明模型方程达到显著水平；失拟项P=0.0610>0.05，表明差异不显著，说明本试验无其他因素的显著影响，模型是适合的，可用于Azotobactersp.strain C-5-2生长条件的优化试验；另外AB以及AC的P值都大于0.05，说明蔗糖浓度与转速以及蔗糖浓度与温度的交互作用对菌株C-5-2生长情况影响不显著，而BC的P值<0.05，则说明温度与转速的交互作用对菌株C-5-2生长情况影响显著。模型的决定系数R2=0.965 1，表示菌株响应值同各因素实际值以及预测值之间具有良好的拟合度，且可信度较高。

(2)响应曲面分析。通过响应面软件分析得到三因素互作的响应曲面，如图5所示，模型的3D曲面以及等高线反映A(蔗糖浓度)、B(转速)、C(温度)3个因素的交互作用对Azotobactersp.strain C-5-2生长情况的影响趋势，当单因素的数值增大时，响应面值也相应增加，当响应面值达到最佳之后，随着单因素数值的增加，响应面值又开始下降[12]，因此能够获得A(蔗糖浓度)、B(转速)、C(温度)这3种因素的极值。分析表明Azotobactersp.strain C-5-2最优生长条件如下：蔗糖浓度10 g/L、转速148 r/min以及温度32℃。在此条件下进行验证试验，在pH 9.0的液体无氮培养基中接种2%的菌液培养20 h后菌株的OD600可达到1.42。

表5 分析回归和方差结果

(a)(b)分别为蔗糖浓度与转速交互作用的3D曲面和等高线；(c)(d)分别为蔗糖浓度与温度交互作用的3D曲面和等高线；(e)(f)分别为转速与温度交互作用的3D曲面和等高线。图5 生长条件的响应面优化试验Figure 5 Response surface optimization test for culture conditions

3 讨论与结论

自生固氮菌在农业生产中发挥重要作用。方华舟等[13]从稻田土壤中筛选得到固氮菌属的菌株，经研究发现其对水稻有明显的促生效果。卢秉林等[14]研究发现圆褐固氮菌N45和生物氮肥在与中量化学氮肥配施时能增加小麦的产量和改善小麦的品质。成艳红等[15]将红壤中筛出的自生固氮菌CM12进行玉米盆栽试验，研究发现施加自生固氮菌剂的玉米土壤中MBN的含量与对照相比提高了2.37倍，同时增加了玉米植株的氮素含量。自生固氮菌不与植物形成宿主关系且适应能力强，所以在实际生产中可广泛应用，同时因其可提高土壤品质、增加农作物产量以及绿色环保等优点已成为21世纪新型肥料发展的重要方向之一[16]，近年来国内外学者对自生固氮菌的筛选尤为重视，何建清等[17]从青稞根际筛选出6株促生效果较好的固氮菌，其中包括假单胞菌属、无色杆菌属以及根瘤菌属等；王娟娟[18]从小麦中筛出20株固氮菌，其中有11株属于固氮菌属(Azotobactersp.)；Tikhonova等[19]在泥炭藓中筛选出一株自生固氮菌株Azospirillumpalustre，编号为B2T；Siddiqi等[20]从活性污泥中筛选出自生固氮菌株Ciceribacterazotifigens等。研究学者致力于筛选出更多的菌株，以丰富固氮微生物的种类，为微生物氮肥提供更多的可能性。

现阶段以联合固氮菌和共生固氮菌的研究内容较多，自生固氮菌的研究相对较少，但自生固氮菌以良好的适应能力以及不依附于植物生存等优势较为明显，好气性的自生固氮菌在固氮方面能力较强[21]，此类固氮菌在全国各地的士壤中都有分布[22]，同时它属于植物促生菌(PGPR)，可促进植物生长发育，具有固氮、溶磷解钾以及分泌植物所需的生长激素等作用。自生固氮菌相比于共生固氮菌根瘤菌来说固氮作用偏低[23]，但其在农业生产中有巨大的应用潜力，可通过生物固氮为小麦、玉米等多种农作物提供氮素等营养物质[24-26]，因此筛选出具有稳定性能以及高效固氮能力的自生固氮菌对农业发展具有重要的意义。

本试验从山西朔州的玉米根际土壤中筛选到一株固氮酶活性达140.14 nmol C2H4/mg.protein.hr自生固氮菌C-5-2，经形态学观察、生理生化鉴定以及16S rDNA序列鉴定为Azotobacter属，命名为Azotobactersp.strain C-5-2，自生固氮菌C-5-2的筛选为固氮菌的研究提供了材料，同时可高效地应用于固氮菌剂中进行资源化利用。在碳源氮源的利用方面，基本与同属的固氮菌利用情况相似[27]，在蔗糖为碳源以及无氮的条件下都能较好生长，因此可在生产应用中简化培养条件并降低生产成本；生长条件的优化结果表明自生固氮菌C-5-2在蔗糖浓度10 g/L、温度32 ℃、转速148 r/min且pH 9.0时生长情况最佳，其中pH的优化试验中发现菌株在中性以及弱碱性环境中都能进行生长且在弱碱性环境中生长最佳，菌株易产酸，在碱性溶液中培养后呈现中性状态，而现阶段报道的菌株适应的最佳pH 5.5～7.2[19,28]，因此本试验筛选菌株与一般的在碱性环境下难以生存的菌株形成差异，在菌肥应用中能更好地用于不同酸碱度的土壤，因此可以更广泛地应用于农业生产中。