基于NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎症通路探讨越婢汤和真武汤对阿霉素肾病大鼠的影响❋

刘慧丹， 宋纯东△， 宋 丹， 陈 瑶， 丁 樱， 贾评评， 花淑婷

(1.河南中医药大学第一附属医院， 郑州 450008；2.河南中医药大学， 郑州 450046；3.河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056002；4.焦作市第二人民医院，河南 焦作 454000)

原发性肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)是以大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿和高胆固醇血症为基本特征的临床综合征[1]。阿霉素是一种常用的蒽环类抗肿瘤抗生素及经典的啮齿类肾炎损伤诱发剂。阿霉素肾病模型是公认的能较好模拟急慢性肾小球病变的模型之一[2]，临床表现与人类NS相似。

感染是NS发生或加重的重要原因。近年研究发现，炎症因子的大量激活与急慢性肾脏病密切相关[3]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain like receptors，NLRs)家族中的血清核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nod-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症复合体成为近年研究的热点，它是以NLRP3为基础骨架，凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-1衔接组成，可以剪切白细胞介素(interleukin,IL)-1β前体成为有活性的IL-1β，进而发挥其生物学效应。NLRP3及其下游炎症因子在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)中发挥重要作用[4]。有研究发现，抑制NLRP3炎症复合体的表达可明显缓解阿霉素肾病模型小鼠的肾小球硬化和肾小管损伤程度[5]。

《金匮要略》越婢汤、《伤寒论》真武汤分别具有宣肺、温阳利水的作用，临床治疗NS水肿疗效显著[6，7]。实验研究发现，二者均能降低NS模型大鼠的蛋白尿，其机制可能与保护肾小球足细胞有关。足细胞是肾小球中终末分化的细胞，对肾脏过滤的完整性至关重要[6,8，9]。本研究旨在同时观察并比较越婢汤及真武汤对阿霉素肾病模型大鼠的疗效，以及对肾组织中相关蛋白NLRP3、Caspase-1及下游炎性因子IL-1β表达的影响，进一步明确其疗效机制，为临床辨证治疗NS提供实验依据。本研究通过河南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查(编号YFYDW 2016-030)。

1 材料与方法

1.1 主要药物、试剂及仪器

真武汤组成：附子9 g，茯苓9 g，白芍9 g，白术6 g，生姜9 g；越婢汤组成：麻黄12 g，石膏25 g，大枣30 g，生姜9 g，甘草6 g，上述药物均加工为颗粒剂(四川新绿色药业科技有限公司)。注射用盐酸阿霉素(浙江海正药业股份有限公司，批号90L0138)；SA1020免疫组化试剂盒、Rabbit Anti-NLRP3、Caspase-1、IL-1βAntibody(苏州卡尔文生物科技有限公司，货号e20190117、e20190112、e20190109、e20190111)；DAB显色剂(北京中杉金桥生物有限公司，货号2040A0911)等。肝肾功生化检测仪(型号AU5821，贝克曼)；24 h尿蛋白定量(24-hour urine protein quantification，24hUTP)检测仪(型号BS2000，迈瑞医疗国际股份有限公司)；光学显微镜(型号BX53，日本奥林巴斯)。

1.2 动物分组及干预方法

清洁级雄性SD大鼠48只，随机分为正常组、模型组、越婢汤组及真武汤组各12只，体质量(200±20)g，购于河南省动物实验中心，实验动物许可证号SCXK(豫)2015-0004。均饲养于河南中医药大学第一临床医学院动物实验室，室温(23±2)℃，湿度(45±2)%，自由饮水，普通饲料。模型制备按参考文献加以改良[10]。所有动物均适应性喂养1周后，除正常组外其余3组均经尾静脉注射阿霉素4 mg·kg-1·d-1，1周后再次给予阿霉素2 mg·kg-1·d-1，正常组注射等量0.9%氯化钠溶液。于第2次注射阿霉素2周后留取24 h尿液，如果24hUTP升高且与正常组比较差异有统计学意义，说明造模成功[11]。造模成功后开始中药灌胃，越婢汤颗粒按9.87 g·kg-1·d-1、真武汤颗粒按4.41 g·kg-1·d-1的剂量，共灌胃6周,正常组与模型组灌服相同剂量0.9%氯化钠溶液。整个实验仅模型组大鼠死亡2只。

1.3 观察指标

1.3.1 大鼠基本情况 观察动物精神状态、活动度、体质量、毛发、摄食及水肿情况等。

1.3.2 生化指标检测 分别在第2次注射阿霉素后的第1、2、8周末禁食不禁水，代谢笼收集大鼠24 h尿液送检24hUTP；于药物灌胃第6周末各组大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射进行深度麻醉(0.3 mL·100 g-1体质量)；剖开大鼠腹腔，腹主动脉取血，自动生化分析仪检测血清白蛋白(Serum albumin，ALB)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)、胆固醇(Cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)表达水平。

1.3.3 肾脏病理检测 处死大鼠后摘取左侧肾脏，剥离肾脏被膜，经肾门纵向剪切留取半个肾脏，10%甲醛处理、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，肾组织标本切片(厚度为3～5 μm)行HE染色，每组大鼠选择6个标本(×400)，光镜下观察肾脏组织病理变化情况。

1.4 免疫组化法检测肾组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β

肾组织行石蜡切片并梯度脱蜡，修复抗原采用PBS冲洗，置于枸橼酸钠液并放进微波炉，用正常小牛血清封闭后，先后滴加兔抗鼠多克隆抗体NLRP3(1∶1000)、兔抗鼠单克隆抗体 Caspase-1(1∶1000)及IL-1β(1∶100)，在湿盒中4 ℃过夜，第2天行PBS冲洗，之后入二抗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。应用Motic病理图像分析系统半定量分析，每组大鼠选取8个样本，各个样本再随机选取10个视野，将得到的信息输入计算机并获取阳性积分吸光度(Integral absorbance，IA)，IA值越大表示蛋白表达越强。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

造模3组大鼠于第2次注射阿霉素3～5 d后即表现出活动减少、精神不振、蜷卧、反应迟钝、纳差便溏、毛发脱落、枯黄无泽、体质量增加不明显等症状，2周后出现四肢肿胀、腹水。正常组大鼠精神状态、活动、皮毛及摄食等均无明显改变。真武汤组与越婢汤组药物干预后大鼠症状改善，水肿逐步减轻并消失。

2.2 各组大鼠24hUTP比较

造模后第1周末，模型组24hUTP与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模后第2周末、药物灌胃第6周末(造模后第8周末)，模型组24hUTP均明显高于正常组(P<0.05)；药物灌胃第6周末，真武汤组、越婢汤组24hUTP均明显低于模型组(P<0.05)，但2组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠不同时点24 h蛋白尿比较

2.3 各组大鼠血生化指标比较

药物灌胃第6周末，模型组与正常组比较ALB明显降低，ALT、Scr、BUN、CHOL和TG均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，真武汤组、越婢汤组ALB明显升高，Scr、CHOL和TG均明显降低(P<0.05)。真武汤组与越婢汤组比较，各指标差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠肝肾功及血脂比较

2.4 各组大鼠肾脏病理形态学变化

HE染色显示，光镜放大400倍观察，正常组大鼠肾组织未见明显病理变化，模型组有少量肾小球系膜轻度增生，包氏囊增厚，少量蛋白管型，球囊黏连，部分肾小球肥大和肾小管扩张或萎缩，间质可见局灶炎性细胞浸润；真武汤组、越婢汤组较模型组病理改变明显减轻，2组比较差异无统计学意义(见图1)。

图1 各组大鼠肾脏病理形态学变化(HE×400)

2.5 各组大鼠肾脏组织NLRP3、IL-1β、Caspase-1免疫组化检测结果

NLRP3、IL-1β、Caspase-1主要表达于肾小管及间质细胞。与正常组比较，模型组NLRP3 、IL-1β、Caspase-1表达水平均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，真武汤组及越婢汤组NLRP3 、IL-1β、Caspase-1表达水平均明显降低(P<0.05)，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表3图2)。

表3 各组大鼠肾脏NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达结果

注：Nod-like Receptor Pyrin Domain Containing 3(NLRP3) 、半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-1、白细胞介素(interleukin,IL)-1β图2 各组大鼠肾组织NLRP3、IL-1β、Caspase-1免疫组化染色结果(×200)

3 讨论

NS以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症及水肿为主要表现，常反复发作。感染、血栓、急性肾损伤、蛋白及脂代谢紊乱为其常见的并发症，部分患者可出现肾功能损害并进行性加重，极易发展为终末期肾衰竭，预后较差，给患者、家属及社会造成了沉重的经济负担[12]。对NS的治疗，现代医学多应用糖皮质激素及免疫抑制剂，虽然大多数患者能够缓解或临床痊愈，但因众所周知的毒副作用以及停药后的反复或复发，令病程迁延，甚至因严重感染、重要部位的血栓而致命，都是极为棘手的临床问题。因此，探讨中医药有效的治疗方剂及其疗效机制，对NS防治及西药减毒增效具有重要意义。

依据NS的临床表现，其属于中医学“水肿”“尿浊”等范畴，其主要病机是本虚标实、虚实夹杂，本虚常以脾肾阳(气)虚、气阴两虚证为主，标实以风邪外袭、水湿、湿热及瘀血常见。《伤寒论》真武汤为脾肾阳虚所致水肿而设，研究发现该方可以调节肾上腺皮质功能，改善醛固酮代谢、ALB、24hUTP及水肿等，并可纠正慢性肾衰早期多尿、尿比重下降、水代谢紊乱，进而保护肾功能[13]，能够调整肾阳虚实验大鼠的肾功能，改善肾小球滤过膜的通透性，促使代谢产物Scr、BUN排出，减少血浆白蛋白的大量丢失[14]，减轻肾阳虚型慢性肾衰模型大鼠肾组织病理损伤[15]。《金匮要略》云：“风水恶风，一身悉肿，脉浮不渴，续自汗出，无大热，越婢汤主之。”现代药理研究表明，越婢汤对阿霉素肾病大鼠有降低蛋白尿、改善肾小球超微结构、修复肾小球电荷屏障的作用[16]，可以通过调控瞬时受体电位离子通道(transient receptor potential channels，TRPC)，下调肾小球足细胞主要表达的TRPC5及TRPC6，改善足细胞损伤[6]。前期研究发现，真武汤和越婢汤均可通过上调阿霉素肾病大鼠肾组织水通道蛋白1(aquaporin-1,AQP1)/水通道蛋白2(aquaporin-2,AQP2)的表达，减轻肾脏病理损害而降低蛋白尿并保护肾功能[17]。本研究发现，阿霉素肾病大鼠模型建立后，模型组与正常组比较24hUTP明显增高，ALB明显下降，血脂水平明显升高；而采用越婢汤及真武汤干预后，2组与模型组比较ALB升高，24hUTP、Scr、CHO和TG均降低，ALT和BUN无明显差异，而肾脏病理部分肾小球肥大、毛细血管袢变窄、肾小管扩张、管腔可见蛋白管型、细胞外基质增生等均明显改善。上述结果提示，二者均有明显的降低阿霉素肾病模型大鼠蛋白尿、保护肾功能及减轻病理损伤的作用，与国内相关研究基本一致。但2治疗组比较差异无统计学意义。

近年来研究发现，炎症通路在急慢性肾脏疾病的进展中起核心作用[18]。NLRP3是由位于染色体1q44上NLRP3基因编码的蛋白，包含1016个氨基酸[19]，其吡啉结构域 (pyrin domain，PYD)可与ASC的同型蛋白相互作用，通过衔接蛋白ASC来募集Caspase-1。NLRP3蛋白、ASC及Caspase-1共同组成一个蛋白复合物，即NLRP3炎症复合体[20]。NLRP3炎症复合体是目前研究最为清楚的影响NS发生发展的炎性小体[21]。正常情况下，NLRP3有自我调节作用，但当存在NLRP3激动剂时，它可寡聚化并募集ASC，继而活化Caspase-1。根据引起相应细胞事件的不同，可将Caspase分为促炎症型和促细胞凋亡型，Caspase-1属于促炎症型，以IL-1β和IL-18前体作为底物，通过蛋白裂解方式，使该因子以成熟的形式释放至胞外发挥生物学作用。研究证实，许多疾病如多发性硬化、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、2型糖尿病等均涉及NLRP3炎症复合体(Caspase-1-IL-1β/IL-18)的激活[22]；健康人肾脏的远曲小管和集合管稳定表达IL-18、Caspase-1以及嘌呤受体P2X7[23]，在各种感染或非感染性疾病中，肾组织Caspase-1、IL-1β表达水平上调，目前已在体内和体外实验中证实人和鼠肾脏的足细胞[24-26]、肾小管上皮细胞[27，28]等均可以表达NLRP3炎性小体，并活化Caspase-1后分泌IL-1β和IL-18 等炎症因子而发挥作用，表明NLRP3炎症复合体激活可能在肾脏疾病的病理过程中发挥着关键的作用。

本研究显示，模型组大鼠肾间质内大量炎性细胞浸润，肾组织内NLRP3、Caspase-1 、IL-1β等表达都高于正常组，说明NLRP3炎症复合体高表达于阿霉素肾病鼠模型肾组织中，并可能参与该病的发生和发展，与上述研究结果一致；中药治疗后2组NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白在肾组织表达水平均明显下降。同时发现，各种生化指标及肾脏病理改善与NLRP3、Caspase-1、IL-1在肾组织表达水平下降呈正相关。这一结果提示，越婢汤、真武汤均可能通过下调肾组织NLRP3/Caspase-1/IL-1β的表达，抑制炎症而发挥消肿、减少尿蛋白、改善肾脏功能及减轻肾脏病理损害的作用，但二者之间比较无明显差异。

越婢汤主要用于水肿初期风水相搏、肺气不宣所致者，而真武汤多用于水肿迁延不愈，病程较长，辨证属于脾肾阳虚且以肾阳虚为主者。虽然临床都属于NS，但有可能病理上有微小病变和局灶节段硬化之区别，二者均属于足细胞病范畴。本研究未发现2组中药生化、病理及NLRP3/Caspase-1/IL-1β在肾组织表达的明显差异，可能与检测的频次少、间隔时间过长有关，未能够及时反映和发现整个实验过程中不同阶段和时期中药不同治法的优势。如果增加大样本量，实验过程中每周都进行生化、病理及上述炎症因子检测，可能会发现2组不同利水经方在疾病不同时期的各自优势，上述均尚有待进一步的研究与探索。

综上所述，炎症在NS的发生发展中越来越受到关注，越婢汤、真武汤是利水的经典方剂。本研究结果提示，2种利水法均可通过影响阿霉素肾病大鼠肾组织NLRP3炎性复合体的表达、抑制炎症反应而达到治疗NS的作用。