HPLC-MS/MS 法测定动物源食品中7 种磺胺类药物残留

罗长琴，朱显平 ，任 静，谭春蓉，熊 双

（1. 重庆市万州食品药品检验所，重庆 404100；2. 重庆安全职业技术学校，重庆 404100）

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs） 是一类具有对氨基苯磺酰胺结构药物的总称，具有较强的抗菌作用[1-2]，是治疗耳部、尿路、皮肤和软组织感染的常见抗生素，因其价廉、抗菌谱广，被广泛用于畜禽和水产养殖领域[3]，在保证动物性食品供应充足方面发挥着巨大作用。但磺胺类抗生素的不合理使用和本身降解速度慢的特点，可通过动物源食品在人体内蓄积，造成机体过敏、造血紊乱、泌尿系统损害、耐药性增强等危害[4-6]。因此，为了保障动物用药的安全性和有效性，以及动物源食品的食用安全[7]，许多国家均对食品中磺胺类药物的最高残留量做出了限量规定，如我国规定所有食用动物（肌肉、脂肪、肝、肾） 和鱼类（皮和肉） 的最大残留量（Maxi mum Residue Limits，MRL） 为100 μg/kg[8]。

目前，磺胺类残留量的分析方法包括高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[9-10]、酶联免疫分析法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[11]、超高效液相色谱- 串联质谱法（High Performance Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）[12-14]、气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、高效毛细管电泳法（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）、气相色谱质谱法（Gas Chromatography Mass Spectrometry，GC/MS）、超临界流体色谱法（Supercritical Fluid Chromatography，SFC） 和微生物法等[7]。其中，HPLC-MS/MS 法具有灵敏度高、选择性强、分析时间段短等优势，为最常用的磺胺类药物分析方法。

磺胺类药物残留的前处理包括液液萃取[15-16]、固相萃取[17-18]、基质固相分散萃取[19-20]等方法，这些方法都存在溶剂消耗量大、操作复杂、耗时长等缺点。Prime HLB 是一种新型固相萃取柱，采用“N -乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物”作为反相复合填料，对样品中的蛋白质、脂肪和磷脂等杂质具有较强的吸附能力，且无需活化与平衡，可直接上样，操作极其简便，过柱速度快，与传统固相萃取方式相比较，净化速度可提高40%[21]。采用Prime HLB 前处理方法，结合超高效液相色谱-串联质谱法，建立测定动物源食品中7 种磺胺类药物的测定方法。该方法简便快速、易于操作，可为动物源食品中7 种磺胺类药物残留提供快速检测方案。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2020 年从重庆市超市、菜市场采购猪肉507 批次，畜副产品112 批次，鱼肉762 批次，鸡肉423 批次，共计1 804 批次。

1.2 主要试剂

乙腈（C2H3N）、甲醇（CH3OH），均为色谱纯，德国默克股份公司提供；甲酸（HCOOH），色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司提供；乙酸铵（CH3COONH）4，优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司提供；Prime HLB 固相萃取小柱，沃特世科技有限公司提供；7 种磺胺混合标准溶液：磺胺甲基嘧啶（SMR：质量浓度100 μg/mL，纯度99.9%）、磺胺二甲基嘧啶（SM2：质量浓度100 μg/mL，纯度99.5%）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM：质量浓度100 μg/mL，纯度97.9%）、磺胺地索辛（SDT：质量浓度100 μg/mL，纯度99.0%）、磺胺喹恶啉（SQX：质量浓度100 μg/mL，纯度97.2%）、磺胺氯哒嗪（SCP：质量浓度100 μg/mL，纯度99.5%）、磺胺嘧啶（SDZ：质量浓度100 μg/mL，纯度99.7%），北京曼哈格生物科技公司提供。

1.3 主要仪器

QUINTIX224-CN 型电子天平，德国赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司产品；MILLI Q Advantage A10 型超纯水机，美国MILLIPORE 公司产品；IKA MS3 Digital 型涡旋仪，德国艾卡公司产品；KQ-800DB DZ 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；3-30ks 型冷冻离心机，德国Sigma 公司产品；AB SCIEX QTRAP4500 型液相质谱仪，赛默飞世尔科技（中国） 有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 标准溶液的配制

精密吸取磺胺混合标准溶液1.00 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，即得混合标准中间液，再取不同体积的标准中间液，用10%甲醇水溶液配制成质量浓度为10，20，40，80，100，150，200 ng/mL 的混合标准工作系列，于4 ℃下保存，备用。

1.4.2 样品前处理

将样品解冻后，取具有代表的部分，搅碎，准确称取5.00 g 置于50 mL 离心管中，加入80%乙腈水（含0.2%甲酸） 溶液5 mL，均质30 s，超声（100 W）提取5 min，以转速10 000 r/min 冷冻离心3 min。上清液转入另一支50 mL 离心管中，残渣再加入5 mL 80%乙腈水（含0.2%甲酸） 溶液，均质30 s，超声（100 W） 提取10 min，以转速10 000 r/min 冷冻离心3 min，合并上清液，混合均匀即为提取液。取3.0 mL 提取液过Prime HLB 固相萃取小柱，控制流速1 mL/min，收集接收液过0.22 μm 有机滤膜，即得上机待测液。

1.4.3 分析条件

液相条件：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18型色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱温40 ℃；进样量5 μL；流速0.2 mL/min；流动相：5 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸） （A） 和乙腈（B）。梯度洗脱程序：0~1.00 min，90% A；1.01~3.00 min，90%~10% A；3.01~7.00 min，10% A；7.01~8.00 min，10%~90% A；8.01~10.00 min，90% A 。

质谱条件：电喷雾离子（ES）I 源，多反应监测（MRM） 模式检测，正离子扫描模式，电喷雾电压5 500 V，雾化气50 units，雾化器蒸发温度500 ℃，反吹气30 min，辅助加热气50 min。

磺胺类物质的质谱参数见表1。

表1 磺胺类物质的质谱参数

1.5 数据处理

用赛默飞液质自带数据处理软件进行数据处理，采用Excel 对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 标准品色谱图

在设定的条件下对标准样品进行分析。

7 种磺胺类药物标准溶液（100 ng/mL） MRM 色谱图见图1。

图1 7 种磺胺类药物标准溶液MRM 色谱图

由图1 可知，7 种磺胺类药物分离效果较好，无明显色谱杂质峰干扰。

2.2 标准曲线及线性范围

测定7 种磺胺类药物标准工作溶液（质量浓度均为10，20，40，80，100，150，200 ng/mL），以峰面积（Y） 和对应的质量浓度（X，ng/mL） 作线性方程。在10~200 ng/mL 内，各磺胺类药物的质量浓度与对应的峰面积呈良好线性关系，相关系数R在0.999 11~0.999 95，均在0.995 以上。

2.3 方法学验证

2.3.1 方法检出限和定量限

对空白样品进行加标试验，以3 倍信噪比计算检出限（LOD），10 倍信噪比计算定量限（LOQ），对猪肉、猪肝、鸡肉、鱼肉4 种基质添加混合标准使用液，在多次重复测试下，将7 种磺胺类药物的方法检出限确定为2.5 μg/kg，定量限确定为9.0 μg/kg。

2.3.2 保留时间重复性

以40 ng/mL 的混合标准溶液在1.4.3 仪器条件下进行重复测定6 次。

7 种磺胺类标准物质保留时间的重复性见表2。

表2 7 种磺胺类标准物质保留时间的重复性

由表2 可知，各种标准物质的保留时间的精密度RSD 为0.06%~0.65%，表明出峰时间稳定，作为目标物定性分析结果可靠。

2.3.3 方法回收率及精密度

分别取猪肉、猪肝、鸡肉、鱼肉4 种空白基质加入20，80，160 μg/kg 的低、中、高3 个质量浓度标准混合溶液，按1.4.2 进行前处理，1.4.3 的仪器方法进行含量测定。

猪肉中7 种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差见表3，猪肝中7 种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差见表4，鸡肉中7 种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差见表5，鱼肉中7 种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差见表6。

表3 猪肉中7 种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

表4 猪肝中7 种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差（n=6）/%

表5 鸡肉中7 种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差（n=6）/%

表6 鱼肉中7 种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差（n=6）/%

结果表明，猪肉中7 种磺胺化合物3 个加标水平的平均回收率为71.2%~104.3%，相对标准偏差（RSD） 为0.9%~2.5%；猪肝的平均回收率为70.9%~102.4%，RSD 为0.3%~7.2%；鸡肉的平均回收率为66.3%~103.5%，相对标准偏差（RSD） 为0.2%~4.4%；鱼肉中7 种磺胺化合物3 个加标水平的平均回收率为67.8%~98.8%，相对标准偏差（RSD） 为0.8%~5.5%，这4 种基质中的回收率和精密度结果均能达到国标的要求[22]，可用于定量分析。

2.4 实际样品的测定

2020 年从重庆市超市、菜市场采购猪肉507 批次，畜副产品112 批次，鱼肉762 批次，鸡肉423 批次，共计1 804 批次。其中，1 份猪肉检出SMM（43 μg/kg），1 份鱼肉检出SDT（20 μg/kg）；猪肾检出SDT（48 μg/kg），检出率仅为0.17%，合格率高达100%。

3 结论

采用80%乙腈水（含0.2%甲酸） 溶液提取2 次后，经过Prime HLB 净化，以超高效液相色谱-四级杆质谱联用法建立了动物源食品中7 种磺胺类药物残留的检测方法。通过对猪肉、猪肝、鸡肉、鱼肉进行方法学评价，结果7 种化合物保留时间相对稳定；在线性范围0.2~20.0 ng/mL 上具有良好的线性关系；检出限为2.5 μg/kg，定量限为9.0 μg/kg，在低、中、高3 个加标水平下平均回收率为66.3%~104.3%，RSD 为0.2%~5.5%。该方法操作简单、快速、灵敏度高，适用于动物源食品中7 种磺胺类药物残留的检测。实际样品的检测，仅有1 份样品检出磺胺间甲氧嘧啶和2 份样品检出磺胺地索辛，检出率为99.8%，且不存在超标现象，表明近年来动物源食品的磺胺类抗生素残留的监管具有一定的效果。