‘阳光玫瑰’雄性不育株花蕾发育期抗氧化酶活性和内源激素含量的变化

洪 奔，陶建敏，农慧兰，徐颖一，耿艺宁，凌千惠，郑 焕

(南京农业大学 园艺学院， 南京 210095)

葡萄是重要的果树经济作物, 在世界农业中占有重要地位，雄性不育在提高水果无核品质、增加产量、商业化批量杂交育种等方面尤为重要[1]。葡萄雄性不育系因其单性结实的特性可培育无核品种，同时在杂交育种中作为母本免去人工去雄这一过程，可极大提高育种效率[2]。因此，研究和应用雄性不育对葡萄雄性不育新种质的合理开发与利用具有重要意义。

植物雄性不育的发生过程中通常伴随着异常的生理代谢特征。冯小磊[3]认为植物雄性不育的生理生化特性研究可将植物遗传与个体表型变异联系起来, 有助于揭示植物雄性不育发生机理。近年来, 不少学者在膜脂过氧化和内源激素方面对植物雄性不育材料的生理生化机制进行了研究, 取得了一系列新进展。活性氧在植物中的积累被认为是雄性不育产生的重要原因之一。它可以使细胞膜中不饱和脂肪酸发生过氧化 或脱脂化,逐级降解为MDA，一般认为MDA在植物体内积累是活性氧毒害的表现，其含量是判断膜脂过氧化程度的一个重要指标。植物在长期演化过程中形成了防御活性氧的保护机制，其中抗氧化酶系统发挥至关重要的作用[4]。高羊茅[5]、百合[6]、厚轴茶[7]等植物不育株花蕾发育过程中POD、SOD、CAT等抗氧化酶活性较可育株表现出不同程度的差异，而花蕾发育阶段MDA含量通常高于可育株。前人普遍认为在雄性不育发生过程中会产生大量的活性氧，导致MDA升高，可能是植物败育的一个重要原因[8]。另外，植物内源激素参与细胞、组织、器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发等诸多方面生理活动，单独或协同调控植物的生长发育过程。目前，大量研究表明植物花蕾不同发育时期内源激素含量发生变化，都将影响植物自身花药育性，造成雄性不育[9]。茄子[10]、大豆[11]等作物雄性不育研究结果表明，不育系花器官发育过程中IAA、ABA、GA3、CTK、JA、BR等内源激素含量异常以及内源激素平衡失调与雄性不育的发生紧密相关。

‘阳光玫瑰’葡萄为欧美杂交种。该品种生长势强、抗病性强、丰产质优、口感香甜、市场认可度高。‘Y-14’为南京农业大学选育的4株‘阳光玫瑰’实生后代雄性不育优良单株，于2017年定植，有性繁殖；其雄蕊花丝极短，且紧紧包裹雌蕊不易开裂(图1)，花粉无活力；自然授粉果穗大小粒现象严重，无核率达96%，花前套袋为全无核果实。目前，关于葡萄雄性不育材料生理生化方面的研究较少。本研究以‘阳光玫瑰’实生后代雄性不育株‘Y-14’和‘阳光玫瑰’各发育期花蕾为试材，测定花粉母细胞时期、减数分裂时期、四分体时期、单核早期、单核晚期、二核期、成熟花粉粒时期的抗氧化酶活性和内源激素含量，从而揭示葡萄不育株‘Y-14’膜脂过氧化、内源激素含量与雄性不育之间的关系，阐明葡萄雄性不育的生理代谢特征，为葡萄雄性不育新种质的合理开发与利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地点与材料

以南京农业大学汤山翠谷葡萄基地的‘阳光玫瑰’实生后代雄性不育株(编号‘Y-14’)和‘阳光玫瑰’为实验材料(图1)。从2021年4月下旬幼蕾期开始采集花蕾至5月中上旬开花为止，每3 d采集1次，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存；将花蕾分为花粉母细胞时期、减数分裂期、四分体期、单核早期、单核晚期、二核期及成熟花粉粒时期。

1.‘Y-14’正视图；2.‘Y-14’俯视图；3.‘阳光玫瑰’正视图；4.‘阳光玫瑰’俯视图

1.2 测定项目

花蕾样品POD、CAT、SOD活性和MDA含量采用试剂盒测定。试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，样品的处理及各项指标测定均按照试剂盒使用说明书进行，每个样品重复测定3次。

花蕾样品内源激素含量的定性定量分析采用ESI-HPLC-MS/MS法。以异丙醇-水-盐酸提取植物样品内源性激素(endogenous phytohormones)，以安捷伦(Agilent)1290 高效液相色谱仪串联AB Sciex QTRAP 6500+质谱仪测定植物内源性激素IAA、ABA、反式玉米素核苷(TZR)、茉莉酸甲酯(MeJA)、GA3含量，并在提取过程中加入内标物质校正检测结果。(1)标准溶液配制：以甲醇(0.1%甲酸)为溶剂配制浓度梯度为0.1、0.2、0.5、2、5、20、50和200 ng/mL的IAA、ABA、TZR、MeJA、GA3标准溶液，并加入终浓度为20 ng/mL的内标溶液，在实际绘制标准曲线方程时剔除线性异常点。(2)液相条件：色谱柱：Poroshell 120 SB-C18反相色谱柱(2.1×150，2.7 μm)；柱温：30 ℃；流动相：A∶B=(甲醇/0.1%甲酸)∶(水/0.1%甲酸)；洗脱梯度：0～1 min，A=20%；1～9 min，A递增至 80%；9～10 min，A=80%；10～10.1 min，A 递减至 20%；10.1～15 min, A=20%；进样体积：2 μL。(3)质谱条件：电喷雾电离源 ESI(electron spray ionization)雾化温度：400 ℃；气帘气(curtain gas，CUR)：15 psi；喷雾电压(ion spray voltage，IS)：4 500 V；雾化气压力(Gas1)：65 psi；辅助气压力(Gas2)：70 psi；监测模式：MRM(多反应监测模式 multiple reaction monitoring)。在Q-Trap6500 中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)进行扫描检测。

1.3 数据处理

GraphPad Prism 8.0.1使用Analyst及GraphPad Prism 8.0.1进行处理数据及数据分析，Excel 2019作图。

2 结果与分析

2.1 ‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾各发育时期抗氧化酶活性及MDA含量比较

2.1.1 POD活性‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾POD活性随着花蕾发育时期总体呈逐步下降趋势(图2,A)。其中，各发育时期‘Y-14’花蕾POD活性都显著低于‘阳光玫瑰’POD活性；‘Y-14’与‘阳光玫瑰’的POD活性差异较大时期集中出现在花蕾发育的四分体时期(S3)和单核早期(S4)，此时‘Y-14’POD活性分别为同期‘阳光玫瑰’的75.71%和57.31%。

2.1.2 SOD活性图2,B显示，‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾SOD活性在花蕾发育时期总体上呈先下降后上升趋势。其中，‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾SOD活性均单核早期(S4)最低；整个花蕾发育过程中，‘Y-14’SOD活性始终显著低于同期‘阳光玫瑰’，并分别以花粉母细胞时期(S1)和单核早期(S4)差异最大和最小，分别占同期‘阳光玫瑰’的37%和59.21%。

2.1.3 CAT活性如图2,C所示，‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾CAT活性在花蕾发育时期总体上呈缓慢下降趋势，‘Y-14’在四分体时期(S3)有骤降现象。其中，‘Y-14’花蕾CAT活性除减数分裂期略高于‘阳光玫瑰’外，其余时期均低于‘阳光玫瑰’，且除花粉母细胞期(S1)和减数分裂期(S2)外，两者差异均达到显著水平；‘Y-14’花蕾的CAT活性与‘阳光玫瑰’差异在花蕾发育四分体期、单核早期、单核晚期更为明显，分别占同期‘阳光玫瑰’的70.41%、71.92%和63.36%。

2.1.4 MDA含量‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾的MDA含量在花蕾发育过程中呈逐步下降的趋势，且总体而言，‘Y-14’花蕾的MDA含量要始终明显高于同期‘阳光玫瑰’(图2,D)。其中，‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾的MDA含量均在单核晚期至二核期下降幅度较大；在花粉母细胞时期(S1)和单核晚期(S5)，‘Y-14’与‘阳光玫瑰’之间的MDA含量差异尤为明显，‘Y-14’MDA含量分别为同期‘阳光玫瑰’的1.38倍和1.34倍。

*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01); S1.花粉母细胞期；S2.减数分裂期；S3.四分体期；S4.单核早期；S5.单核晚期；S6.二核期；S7.成熟花粉粒期;下同

以上结果说明‘Y-14’各发育时期抗氧化酶活性总体上低于‘阳光玫瑰’，而MDA含量高于‘阳光玫瑰’，说明‘Y-14’较‘阳光玫瑰’膜脂过氧化程度更严重。两材料花蕾POD与CAT活性总体上呈下降趋势，POD活性从花蕾发育早期即差异显著，而CAT活性在四分体期差异极显著；两材料花蕾SOD活性均在单核早期达到最低，然后在单核早期突然上升，且各时期均差异显著。

2.2 ‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾发育期内源激素含量变化特征

2.2.1 IAA含量如图3,A所示，在葡萄花蕾发育过程中，‘Y-14’花蕾IAA含量始终不同程度地高于同期‘阳光玫瑰’，但仅在花粉母细胞时期、四分体时期和单核早期差异达到显著水平；‘Y-14’花蕾IAA含量总体呈下降趋势，‘阳光玫瑰’花蕾IAA含量变化趋势不明显。其中，‘Y-14’花蕾IAA含量在四分体时期达到最大值，而‘阳光玫瑰’IAA含量在单核早期达到最大值；‘Y-14’的IAA含量在花粉母细胞时期、四分体时期与‘阳光玫瑰’表现出显著差异，分别是同期‘阳光玫瑰’的1.80倍、1.46倍。

2.2.2 GA3含量‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾GA3含量在花蕾发育过程中均呈先上升后下降的变化趋势(图3,B)。其中，‘Y-14’花蕾GA3含量在花蕾发育前期(S1～S3)低于‘阳光玫瑰’，在单核早期(S4)开始高于‘阳光玫瑰’含量，但在S1～S4期间两者间差异均未达到显著水平；Y-14’花蕾GA3含量在单核期(S5)和二核期(S6)显著高于同期‘阳光玫瑰’(P<0.05)，并以二核期差异最大，此时‘Y-14’GA3含量是‘阳光玫瑰’的1.84倍；‘Y-14’GA3含量在花粉成熟期(S7)又明显降低，稍低于同期‘阳光玫瑰’。

2.2.3 ABA含量‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾ABA含量在花蕾发育过程中总体呈上升趋势，‘阳光玫瑰’ABA含量在单核早期(S4)显著大幅上升，但‘Y-14’ABA含量的变化相对比较平缓(图3,C)；在花蕾整个生长发育过程中，‘Y-14’花蕾ABA含量始终显著低于同期‘阳光玫瑰’，且在花粉母细胞时期就达到极显著水平，此时仅为‘阳光玫瑰’的23.42%。

2.2.4 TZR含量图3,D显示，‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾TZR含量在花蕾发育期总体上变化平缓且普遍含量较低(0.05 ng/g左右)，‘Y-14’TZR含量始终低于同期‘阳光玫瑰’，但它们之间在各发育时期始终差异不显著。

2.2.5 MeJA含量在花蕾发育过程中，‘Y-14’花蕾MeJA含量总体呈升高-降低交替变化的趋势，并在减数分裂期达到最高，而‘阳光玫瑰’花蕾MeJA含量总体呈上升趋势，并在花粉母细胞时期最低，在成熟花粉粒时期达到最高(图3,E)。‘Y-14’花蕾MeJA含量在花蕾发育前期明显高于同期‘阳光玫瑰’，并在花粉母细胞时期差异极显著水平，是同期‘阳光玫瑰’的2.56倍；从单核早期(S4)开始，‘Y-14’花蕾MeJA含量均不同程度地低于同期‘阳光玫瑰’，并且其间差异随着发育时期越来越明显，在二核期和花粉成熟期均达到极显著水平。

图3 ‘Y-14’与‘阳光玫瑰’花蕾发育期内源激素含量的变化

以上结果说明整个花蕾发育期以ABA的含量在‘Y-14’与‘阳光玫瑰’间差异尤其显著，ABA在葡萄花蕾中具有一定的组织特异性。‘Y-14’花蕾IAA含量在花蕾发育过程中高于‘阳光玫瑰’，与ABA呈一定程度负相关。‘Y-14’的MeJA与ABA含量在花粉发育后期均极显著低于‘阳光玫瑰’，而GA3含量在花粉发育中后期略高于‘阳光玫瑰’，与ABA存在一定程度负相关。‘Y-14’和‘阳光玫瑰’的TZR含量普遍偏低(0.05 ng/g左右) 且无显著差异，就本研究结果来看，TZR含量变化与‘Y-14’雄性不育的形成无直接关系。

3 讨 论

3.1 ‘阳光玫瑰’葡萄雄性不育与膜脂过氧化的关系

在本研究中，不育系‘Y-14’花蕾MDA含量在整个花蕾发育过程中明显高于‘阳光玫瑰’，而其SOD、POD、CAT活性总体低于‘阳光玫瑰’。此外，‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾的MDA含量都在花蕾发育前期最高而后总体呈下降趋势，这可能与其SOD活性在花蕾发育中期突然升高有关。SOD作为植物细胞中最主要的抗氧化酶，其作为抗氧化酶防御系统的第一道防线，加之较其他抗氧化酶更为稳定的特点[18]，其活性变化往往直接影响MDA的含量。由此可见，‘Y-14’和‘阳光玫瑰’葡萄本身抗氧化酶防御系统亦存在一定的应激反应。综上，本研究中‘Y-14’花蕾的抗氧化酶系统活性较‘阳光玫瑰’降低，而其MDA含量升高，可能是造成‘Y-14’败育的原因；同时，‘Y-14’与‘阳光玫瑰’抗氧化酶系统中SOD活性差异最为显著，推测SOD活性是影响‘阳光玫瑰’实生后代雄性不育的关键。这与其他一些作物雄性不育研究类似，但也存在与之相反的结论。如刘倩在‘魏可’葡萄研究中发现不育株SOD活性高于可育株[19]。因此，即使在相同物种的不同品种中，相关研究结论也不尽相同，这可能与植物种类、不育发生关键时期，甚至栽培条件与生长条件均有关。

3.2 ‘阳光玫瑰’葡萄雄性不育与内源激素的关系

植物通过内源激素调控能量代谢、物质代谢、信号传导以及基因表达等诸多方面，内源激素平衡维持植物正常的生理活动，保证植物正常的生长发育[20]。迄今为止，大量研究表明植物内源激素如IAA、GA3、ABA、CK、JA、BR等与雄性不育的发生密切相关，相关内源激素含量过高或是过低都会引起植物雄性不育[13]。本研究所测的5种内源激素中，整个花蕾发育期以ABA的含量在‘Y-14’与‘阳光玫瑰’间差异尤其显著。研究表明：ABA可诱导植物体内相关酶的重新合成来提高植物的抗逆性[31]，在小麦的研究中发现ABA可以显著提升小麦抗氧化酶(POD、SOD和CAT)活性[21]。故推测‘Y-14’花蕾ABA含量较低导致了抗氧化酶活性的降低，加剧了‘Y-14’的膜脂过氧化，最终导致雄性不育。这与‘魏可’葡萄不育株中的研究结果一致[22]。然而，也有大量研究表明ABA含量过高会影响维管系统的发育，促使营养物质转运受抑制，小孢子母细胞因营养匮乏发育受阻，从而造成雄性不育[7]。刘红艳认为ABA盈积可能会伴随着花粉母细胞的衰老和死亡,导致花粉败育和雄性不育的发生[23]。这一观点与西瓜[24]小麦[25]的研究结果类似。马艳青认为同一内源激素在不同的作物种类中与雄性不育的关系表现并不一致，不同的植物或不育源可能存在不同的调控基因[26]，因此推测葡萄雄性不育发生与ABA含量关系具有物种特异性。

前人普遍认为IAA的亏损会导致植物维管束的异常发育，影响营养物质在花药的正常分配，从而导致雄性不育[27]。研究发现小麦[27]、西瓜[24]等植物中不育系IAA含量均低于可育系。本研究结果却与之相反，‘Y-14’花蕾IAA含量在花蕾发育过程中显著高于‘阳光玫瑰’，这可能与ABA能抑制IAA的合成有关，‘阳光玫瑰’花蕾ABA含量较高导致了IAA含量的降低。也有研究表明POD活性升高可能会导致IAA的分解[7]，‘阳光玫瑰’POD活性较高也可能导致了IAA含量的降低。另外，在百合[6]、水稻[3]、油菜[28]多项研究中发现不育株IAA含量高于可育株。这可能是因为高浓度的IAA可诱导乙烯过量合成，进而促进雄性表达或诱导雄性不育[29]。

GA3是一种活性最高的赤霉素类激素。研究表明，GA3可促进雄花分化，在大白菜[30]、葡萄[22]、西瓜[24]等多种作物中，不育株GA3含量在花蕾各发育时期均低于可育株。在本研究中，‘Y-14’花蕾发育前中期GA3含量低于‘阳光玫瑰’，与前人结果类似；但花蕾发育后期‘Y-14’含量高于‘阳光玫瑰’，这种GA3含量变化情况与厚轴茶中研究结果类似[7]，故推测‘Y-14’花蕾GA3含量在花蕾发育前期和发育后期异常变化可能导致花粉母细胞发育异常，从而影响了‘阳光玫瑰’实生后代雄性不育。

MeJA最先在拟南芥中被证明与花药开裂有关[31]，随后在水稻、小麦等大量研究中发现与雄性不育密切相关[32-33]。拟南芥雄性不育突变体中花药不能正常开裂，同时出现JA含量低、花丝伸长受到抑制的现象[34]。本研究中‘Y-14’在花蕾发育后期MeJA含量显著降低的现象与上述研究结果类似。郭航认为JA是诱导花丝伸长、花药开裂的信号分子，在花药开裂过程中起着重要的作用，JA途径中任何阶段的缺陷都会引起类似花丝伸长减少、花药开裂延迟或不开裂的表型[35]。‘Y-14’花丝萎缩、花药粘连不易开裂，推测可能由于MeJA含量的异常变化以及花蕾发育后期MeJA含量的含量较低，未能及时诱导花丝伸长，花药开裂，从而出现雄性不育。

ZR是植物体内普遍存在的一种细胞分裂素，其具有顺式和反式两种形式，即T-trans和C-cis，其中反式(TZR)生物活性远高于顺式(CZR)[20]。前人的研究表明植物花药发育过程中ZR含量过高或过低均可能导致雄性不育的发生。但在本研究中，‘Y-14’和‘阳光玫瑰’的TZR含量普遍偏低(0.05 ng/g左右) 且无显著差异，就本研究结果来看，TZR含量变化与‘Y-14’雄性不育的形成无直接关系。

梨[36]、葡萄[37]、水稻[38]、辣椒[39]、厚轴茶[40]等作物大量细胞学研究表明，单核期是植物发生雄性不育的关键时期。在本研究中，‘阳光玫瑰’花蕾ABA含量在单核早期剧增，而同期‘Y-14’变化平缓；‘Y-14’和‘阳光玫瑰’花蕾SOD活性均在单核早期最低，均在单核晚期剧烈升高。ABA作为应激激素可能在单核早期影响了抗氧化酶尤其是SOD的活性[20-21]。推测在单核早期SOD活性的降低引发了植物自身的应激响应使得ABA含量提升，接着ABA又引导了SOD的重新合成；而由于‘Y-14’花蕾ABA含量变化迟缓，导致SOD活性未能及时提高，加剧了膜脂过氧化，最终引发了雄性不育。另外，‘Y-14’花蕾MeJA含量在花蕾发育前期高于‘阳光玫瑰’，在单核早期开始低于‘阳光玫瑰’且差异愈发明显，这一变化趋势与BNS小麦类似[25]。‘Y-14’花蕾GA3含量也在单核早期开始高于‘阳光玫瑰’。因此推测单核早期可能是‘阳光玫瑰’实生后代雄性不育株花蕾生理生化出现异常的关键时期，这与厚轴茶相关生理生化研究中的结论一致[7]。

综上所述，‘阳光玫瑰’实生后代雄性不育株‘Y-14’花蕾的SOD、POD、CAT活性显著降低，MDA含量增高；其花蕾内源激素ABA、MeJA含量降低，IAA含量增高，GA3含量异常波动，可能与雄性不育的发生有关。‘Y-14’花蕾发育至单核早期，多项指标出现显著变化，单核早期可能是‘Y-14’生理生化出现异常的关键时期。但其中的雄性不育具体机制，还有待进一步研究。