石榴PgUGT基因表达特性与重组表达分析

招雪晴，杨 静，沈 雨，苑兆和*

(1 南方现代林业协同创新中心，南京 210037； 2南京林业大学 林学院，南京 210037；3 日照市自然资源和规划局，山东日照 276800)

石榴(PunicagranatumL.)为千屈菜科(Lythraceae)落叶灌木或小乔木[1]，其果皮、果汁、种子、花和叶中均含有大量的类黄酮化合物[2-5]。类黄酮是广泛分布在植物体内的次生代谢产物，对植物的生长发育和人体的营养保健有重要的调节作用[6-8]。在植物体内，大部分类黄酮通过糖基化反应将糖基(葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖等)转移到受体分子上[9]，形成多样的糖苷化合物。糖基化反应由糖基转移酶(glycosyltransferseas，GTs)催化完成，是植物次生代谢中一种广泛存在的修饰反应[10-11]。

GTs是一个多成员基因家族，根据底物特异性和催化特性，目前在CAZy数据库(Carbohydrate Active enzyme Database)中已鉴定出114个GT家族，其中GT1家族以尿嘧啶核苷二磷酸(Uridine diphosphate，UDP)-糖基转移酶(UGTs)最为常见。UGTs在糖基化反应中具有底物催化的复杂性和区域选择性，为研究类黄酮UGT基因的表达及功能，前人做了大量研究。在猕猴桃[12]、茶树[13]、银杏[14]、桑树[15]、青稞[16]等上的研究表明UGT基因具有表达的组织特异性和时空变化性；而在葡萄[17]、香雪兰[18]、鸢尾[19]等上的研究表明UGT酶具有催化的分化性和复杂性。虽然石榴中参与类黄酮和花色苷合成的UGT已有报道[20-22]，但UGT家族成员众多、功能各异，有必要对家族内的其他UGT基因进行挖掘分析。在‘泰山红’石榴基因组中，有 5个UGT基因可能参与果皮和籽粒花色苷合成[1]，其中，Pg010555.1在果实发育阶段的转录丰度最高。本研究以Pg010555.1(PgUGT)为研究对象，在基因克隆基础上，分析其在果实发育期的表达模式，初步探讨其与类黄酮和花色苷合成的关系；通过构建原核表达载体并转化大肠杆菌，对其进行原核诱导表达。结果有助于加深对石榴UGT催化特性及类黄酮糖基化机制的认识。

1 材料和方法

1.1 材 料

以南京林业大学白马教学科研基地的石榴品种‘泰山红’为材料。分别于2020年7～9月采集样品，共划分为7个采样时期：7月15日、7月30日、 8月15日、8月30日、9月10日、9月20日和9月30日，分别标记为S1～S7(图1)。为保证果实发育状态的一致性，采样时选取生长势基本一致的植株，在树冠的东、西、南、北四个方位分别采摘1个果实，运至实验室后清洗干净，取果实外果皮，液氮速冻后保存至-80 ℃备用。

S1～S7分别代表采样时期(月-日)： 7-15、7-30、 8-15、8-30、9-10、9-20和9-30；下同

1.2 方 法

1.2.1 石榴PgUGT的全长cDNA克隆采用Biomarker Plant Total RNA Isolation Kit(北京， 百迈克)提取果皮总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳对总RNA进行检测。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(大连，Takara)将RNA反转录为cDNA。根据转录组UGT序列设计特异引物UGT-F和UGT-R(表1)进行PCR扩增，采用50 μL 的反应体系：2×TaqMaster Mix 25 μL、10 μmol/L 上下游引物各2 μL、50 ng/μL的cDNA模板2 μL，19 μL的ddH2O。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 1.5 min、72 ℃ 5 min，35个循环。PCR产物经回收纯化后与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR后选择阳性克隆送至上海生工生物工程公司测序。

表1 实验中所用引物

1.2.2 序列分析及系统进化树构建利用ExPASy网站的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白的分子量、等电点、不稳定系数；利用CDD(Conserved Domain Database)鉴定蛋白结构域；利用DNAMAN进行多重比对。从NCBI下载拟南芥及其他物种的UGT氨基酸序列(表2)，利用MEGA-X对序列进行比对[23]，采用邻接法(neighbor-joining method)构建系统进化树，用iTOL软件[24]对构建的进化树进行可视化输出。

表2 用于系统进化树构建的UGT信息

1.2.3 荧光定量PCR(qRT-PCR)分析分别提取7个时期的石榴果皮总RNA，反转录合成第一链cDNA，稀释10倍作为qRT-PCR模板。设计qRT-PCR引物UGT-qF和UGT-qR，以石榴Actin(GU376750)为内参(表1)，采用20 μL反应体系：2 μL的cDNA模板、10 μL MonAmpTMSYBR®Green qPCR Mix (莫纳，武汉)、0.4 μL 上游引物和下游引物、7.2 μL Nuclease-free water。PCR程序设置为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。每个PCR反应设3次重复，以7月15日样品基因表达量为对照，采用2-ΔΔCT法[25]得到每个时期的相对表达量。整个实验过程重复3次，利用SPSS20对PgUGT相对表达量进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey法进行多重比较(P<0.05)。

1.2.4 总类黄酮及总花色苷含量的测定总类黄酮含量的测定采用常规AlCl3比色法，略有改动。以芦丁为标准品得到标准曲线Y=0.013X+0.051 9 (Y为吸光度，X为浓度，R2= 0.999 7)。取0.1 g果皮液氮研磨后加入6 mL 60%乙醇(60∶40，V/V)，超声提取40 min。离心收集上清。取1 mL上清与3 mL 2.5% AlCl3溶液混合，用60%乙醇稀释至25 mL，室温孵育30 min，测定417 nm下的吸光值。根据标准曲线计算总类黄酮含量(mg/g)。所有实验均为3个重复。总花色苷含量的测定采用前期建立的方法进行[26]。

1.2.5 原核表达根据PgUGT的ORF序列，设计含有酶切切点NdeI和XbaI的特异引物(表1)，扩增并回收PgUGT，用限制性内切酶NdeI和XbaI分别对PCR回收产物和载体pCZN1进行双酶切，将PCR产物和载体进行连接，连接产物转化后挑选阳性克隆质粒，经测序鉴定无误后，重组质粒pCZN1-PgUGT转化大肠杆菌ArcticExpress感受态细胞中。挑选单克隆培养过夜，取1 mL菌液转移到含氨苄青霉素(Amp)的新鲜LB培养基中，37 ℃孵育至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37 ℃诱导4 h。离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬，重悬液进行超声破碎后，离心收集上清和沉淀，产物经12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色法检测蛋白表达情况。

2 结果与分析

2.1 石榴PgUGT基因克隆

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的条带与预期大小基本一致(图2)。测序结果经Blast分析后发现，其氨基酸序列与石榴(Punicagranatum，AHZ97875)、杨梅(Morellarubra，KAB1205527)和美洲葡萄(Vitislabrusca，ABR24135)的相似性分别为94.79%、55.51%和54.44%，表明克隆到的基因为石榴糖基转移酶家族成员，命名为PgUGT，在GenBank中的登录号为MW414607。

M. DL2000；1. PgUGT

2.2 生物信息学分析

PgUGT基因开放阅读框(ORF)长度为1 557 bp，编码518个氨基酸，C端含有44个保守的氨基酸序列，即PSPG基序(图3)。编码的PgUGT蛋白分子量为55.9 kD，等电点为6.55，不稳定系数为42.92，属于不稳定蛋白；平均亲水系数为-0.018小于0，为亲水蛋白。CDD保守结构域分析发现，该蛋白属于糖基转移酶GT-B超家族。

阴影部分为PgUGT蛋白的PSPG保守基序

利用MEGA软件，将7个石榴UGTs和 45个其他物种UGTs构建系统进化树。如图4所示，52个UGT可分为A-N等14个类群，外加PgUGT95B2单独一组。其中，PgUGT与报道的PgUGT1和PgUGT2聚为一支，构成了UGT家族中的F类群。该组成员主要以类黄酮和苯甲酸衍生物为底物，催化C3位的糖基化。此外，PgUGT和葡萄的VvGT1和草莓的FaGT2亲缘关系较近。

具体UGT蛋白序列信息见表2

2.3 果实发育期内PgUGT表达分析

qRT-PCR结果显示(图5)，PgUGT基因在果实发育期均有表达，在果实发育前期表达量逐渐升高，在S3时(8月15日)达到峰值，且与其他时期内的表达量具有显著差异；之后，表达丰度逐渐降低，到后期(9月中下旬)表达量达到最低。可见，PgUGT在果实发育期内呈现出前高后低的表达模式，表达高峰出现在发育中期。

不同小写字母表示基因表达量在各采样期存在显著差异(P<0.05)

2.4 总类黄酮及总花色苷含量变化

如图6所示， ‘泰山红’石榴果皮中总类黄酮含量随着时间的推进而不断降低，在幼果期含量最高，到后期果实成熟时则降至最低；对花色苷来说，其含量整体呈现出波动性上升趋势，幼果期含量最低，而在后期含量则达到高峰，这与果实红色不断积累的表型变化相吻合。总体来说，果皮中总类黄酮和总花色苷含量呈现出相反的变化趋势。

不同小写字母表示总类黄酮和总花色苷含量在各采样期存在显著差异(P<0.05)

2.5 原核表达分析

用限制性内切酶NdeI和XbaI双酶切鉴定pCZN1-PgUGT重组质粒，酶切片段大小符合预期(图7)。转化大肠杆菌ArcticExpress后，挑选阳性克隆摇菌培养，IPTG诱导表达后经SDS-PAGE检测，发现在上清中存在一条约58 kD条带，与pCZN1-PgUGT蛋白的分子量基本一致(约为57 kD)，表明重组质粒在37 ℃诱导下以可溶性形式存在(图8)。

1. 酶切前；2. 酶切后； M. DL12000

M. 蛋白 Marker；1. 未诱导；2. 诱导后；3. 诱导破碎后上清；4. 诱导破碎后沉淀

3 讨 论

由UGT糖基转移酶催化的糖基化反应是次生代谢产物普遍存在的一种合成后的修饰反应，也是植物体内维持代谢平衡的主要机制之一，决定了次生代谢产物的活性、水溶性、稳定性、运输性及毒性等[10]。本研究对克隆得到的石榴PgUGT进行了qRT-PCR及原核表达分析，研究其表达特性及重组蛋白表达情况，为后续研究基因功能奠定了基础。

UGT是一个超基因家族，前人已经从石榴中克隆到了多个UGT基因，如参与花色苷合成的UFGT[20-21]，催化黄酮和黄酮醇糖基化的PgUGT95B2[22]；催化形成没食子酰葡萄糖苷的UGT81A23和UGT84A24[27]；催化没食子酸形成没食子酸葡萄糖苷的UGT72BD1[28]。本研究克隆的PgUGT氨基酸序列具有糖基转移酶的保守PSPG基序，表明其属于糖基转移酶基因家族。系统进化树分析将其划分到UGT家族的F组中，该组成员多数具有催化类黄酮糖基化的功能，且糖基化修饰的位点是C3，如草莓的FaGT2[29]、拟南芥的AtUGT78D2[30]、 香雪兰的Fh3GT1[31]等。根据序列比对及进化树分析结果，推测PgUGT为类黄酮3-O-糖基转移酶基因。

qRT-PCR结果表明该基因在果实发育前期表达量较高，随着果实的发育其转录丰度下降，在果实发育成熟的后期基因表达量处于较低水平。黑莓(Rubusspp.)的糖基转移酶基因UGT78H2具有类似的表达模式，其在幼果期表达量最高，后期较低[32]。通过与PgUFGT(KF841620)在‘红宝石’石榴的表达模式相比较[20]，发现在取材时间内两者的表达趋势类似，表明两基因可能都参与了石榴类黄酮物质的糖基化反应。前期的转录组分析表明，PgUGT在‘泰山红’果皮和籽粒中皆为高表达，且在4个发育阶段中表达量差异不大[1]，这与本研究结果有较大差异，这可能来源于取材的时间差异，或转录组测序数据以reads为表达量产生的分析差异。进一步分析发现，PgUGT在果实发育期内前高后低的表达模式与花色苷含量不断升高、类黄酮不断下降的积累模式不完全吻合，这种基因表达与物质合成不一致的现象同样出现在香雪兰Fh3GT1[31]、百日草Ze3GT[33]的研究中。因此，我们推测可能还有另外的糖基转移酶参与石榴类黄酮或花色苷的合成，或者PgUGT同时参与了类黄酮和花色苷的糖基化反应过程。

目前一般有3种方法表征UGTs的催化功能，包括突变体分离克隆、基因克隆并酶学特性分析、异源探针筛选cDNA文库获得目标基因[34]。对于UGT的催化机制和生物学功能研究大都通过以大肠杆菌为代表的原核表达系统和以酵母为代表的真核表达系统进行。其中，原核表达系统具有产量高、稳定性好、易操作等优点，是目前大多数UGTs功能研究的主要途径。因此，本研究构建了PgUGT的重组表达载体pCZN1-PgUGT，并对其进行了诱导表达。在原核表达体系中，类黄酮UGT融合蛋白或者在上清中表达[35-36]，或者以包涵体的形式存在[32, 37]。蛋白聚集成的包涵体为无生物活性的不可溶沉淀，后续还需进行变性、复性等操作进行纯化，成为原核表达系统广泛应用的限制因素。本研究中在37 ℃诱导4 h条件下PgUGT目的蛋白以可溶性形式存在，这有助于后续的研究。

综上，本研究从石榴中获得了一个类黄酮糖基转移酶PgUGT，其表达量在果实发育过程中呈现先升后降的趋势，与总类黄酮含量的逐渐下降和总花色苷含量的逐渐上升趋势不同。原核表达结果显示重组质粒可在大肠杆菌中可溶性表达。该结果为进一步研究PgUGT的功能及其在石榴类黄酮糖苷化反应中的作用奠定了理论基础。