一种Hg2+敏感的反蛋白石光子晶体荧光传感薄膜

李 恒，沙夜龙，孙溢敏，冯广东，韩 波*，张玉琦*

（1.延安市新能源新功能材料重点实验室；陕西省化学反应工程重点实验室；延安大学化学与化工学院；2.延安油气产品质量检验检测有限责任公司，陕西延安 716000）

金属汞（Hg）是一种对人类健康有害的重金属元素之一，也是主要的环境污染物之一，以离子及其他衍生物形式广泛存在于饮用水、食物及药材等［1-2］。如甲基汞作为化妆品中的一种常用添加剂，对皮肤具有一定的美白效果，但因其具有亲脂性，能够在人体内进行积累，会对人类肾脏、肝脏、脑组织以及神经系统产生极大损伤［3-5］。因此，开发一种快速且高效检测Hg2+的方法具有重要的意义。目前，检测Hg2+的方法主要有原子吸收光谱法［6］、伏安法［7］、共振光散射法［8］等。以上方法需要精密仪器且操作复杂、样品制备繁琐。近年来，荧光法［9-10］和比色法［11-12］因试样用量少、灵敏度高、响应快速、选择性好、检测限低且操作简单而受到广泛关注。

光子晶体是2种或2种以上的介电常数不同的材料在空间呈周期性排布的微构材料，由于其独特的能带结构和慢光子效应在传感检测领域得到了快速发展。而根据光子晶体的慢光子效应增强荧光特性开发了各种荧光传感薄膜，用以高灵敏检测各类化合物，如检测爆炸物［13］、甲醛［14-15］、金属Bi3+［16］等。

本文制备了以SiO2为骨架的具有三维孔状结构的反蛋白石光子晶体薄膜，填入与Hg2+具有专一作用的荧光探针分子罗丹明B衍生物（RM），RM与Hg2+的专一性配位生成荧光产物及光子晶体慢光子效应增强荧光特性，最终实现了对Hg2+的高灵敏、高选择性检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

不同粒径的聚苯乙烯（PS）微球购自上海辉质生物科技有限公司；罗丹明B衍生物（RM）根据文献方法合成［17］，结构式如图1所示，经核磁共振光谱表征证明。实验所用其他化学试剂均为分析纯，商业购买后直接使用。

图1 罗丹明B衍生物（RM）的结构式

SU8010场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；PG-2000-Pro-Ex光纤光谱仪，中国上海复享光学股份有限公司；Cary Eclipse荧光光谱仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 RM填充的多孔传感薄膜的制备

首先通过牺牲模板法制备了具有不同光子禁带的SiO2反蛋白石光子晶体薄膜。具体方法参照文献方法［18］。通过PS微球乳液与SiO2溶胶在恒温60℃，恒湿60%的条件下，竖直沉积共组装制备得到PS-SiO2复合的光子晶体薄膜；然后用四氢呋喃溶解去除PS微球模板，得到以SiO2为骨架的具有三维孔状结构的反蛋白石光子晶体薄膜（IOPC）。采用粒径分别为350、370、400和450 nm的PS微球制得的薄膜分别标记为IOPC350、IOPC370、IOPC400和IOPC450。将350、370和450 nm 3种粒径的PS乳液混合均匀，按照同样的方法制备得到无序多孔SiO2薄膜，记为PFNon，作为对照样品。

取一定体积100µmol/L RM的乙醇溶液滴涂至制备得到的不同薄膜表面，待溶剂挥发后得到对Hg2+敏感的荧光传感薄膜，分别记为RM-IOPC350、RM-IOPC370、RM-IOPC400、RM-IOPC450和RM-PFNon。

1.3 Tris-HCl缓冲液及金属离子储备液的制备

不同pH值的Tris-HCl缓冲溶液的制备：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.61 g，溶于水后转移至500 mL容量瓶中，用0.01 mol/L的稀盐酸调节至所需pH，加水定容后混合均匀备用。

不同金属离子储备液的制备：分别称取一定量的Hg2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+、Bi3+、K+、Na+、Mn2+、Pb2+、Ca2+的盐酸盐溶于0.01 mol/L Tris-HCl（pH=7.0）缓冲溶液中，制备得到浓度为100 mmol/L的不同金属离子储备液，待用。以上14种金属离子配置好后，各取500µL于10 mL的容量瓶中定容，混合均匀，各离子浓度为5 mmol/L，作为金属离子混合样品（标记为Mixture）待用。

2 结果与分析

2.1 光子晶体的表征

首先对制得的不同薄膜进行了表面形貌表征。以400 nm的PS为模板制备的各个薄膜为代表，扫描电镜照片见图2。图2A为PS与Si O2溶胶共组装制得的薄膜PC400的表征结果，PS微球高度有序排列，微球之间为共沉积的SiO2纳米粒子；经四氢呋喃溶解去除PS微球后，得到以SiO2为骨架的空气微球高度有序排列的三维多孔结构的传感薄膜（图2B）；而在填充了RM后，薄膜的表面形貌无明显变化（图2C），是由于填充量很少的缘故。在未填充RM时IOPC400呈现薄膜本身结构颜色（图2B插图），由于RM分子本身为粉红色，因此填充后光子晶体薄膜表面呈现粉色（图2C插图）。而对于制备的PFNon，由于PS粒径的不均一，导致组装后PS成无序排列，所制备的对应的多孔薄膜也是空气孔无序排列的结构。

图2 SEM照片（插图为对应薄膜的光学照片）

对制备的不同薄膜的反射光谱进行表征以获取光子晶体光子禁带的位置，如图3所示。IOPC350、IOPC370、IOPC400和IOPC450的反射峰位分别位于541、586、632和730 nm，填充RM后反射峰红移至554、600、645和740 nm，移动了10～14 nm，由布拉格方程可知，反射光谱红移是由于RM的填充使薄膜的 平均折射率有所增大所致。

图3 IOPC350、IOPC370、IOPC400、IOPC450及PFNon填充RM前后的反射光谱

2.2 荧光测试条件的优化

基于罗丹明衍生物对溶液pH的敏感性，研究了不同pH的乙腈：Tris-HCl（v∶v=1∶1）缓冲溶液中传感薄膜与Hg2+响应前后的荧光性质。图4A为RMIOPC400浸入不同pH的溶液中避光放置30 min，加入5 mmol/L Hg2+前后585 nm处的荧光强度。当pH＜7且无Hg2+时，薄膜均发射强荧光，且随pH增大荧光强度减弱。这是因为螺吡喃式的RM在酸性条件下内酰胺开环而产生荧光［19］；当pH≥7时，薄膜荧光猝灭，至碱性条件下完全猝灭，这是由于随着碱性增强，开环的分子重新形成螺吡喃形式。而当Hg2+存在时，在pH≤7的范围内，薄膜显示较强的荧光，同样随pH增大而减弱，但明显强于无Hg2+存在时的荧光。这是因为在pH＜7时主要是Hg2+诱导RM的内酰胺开环并与汞离子配位产生荧光［17］；当pH＞7时，由于Hg2+与OH-反应，使得探针分子无法与Hg2+配位因而荧光发生猝灭。显然，在pH=7时，该薄膜在与Hg2+响应前后荧光变化最为明显，荧光光谱如图4B所示。因此，后续测试均在pH值为7的缓冲溶液中进行。

图4 (A)RM-IOPC400在不同pH Tris-HCl缓冲溶液中与Hg2+响应前后的荧光强度变化;(B)pH=7时的荧光光谱

2.3 光子晶体传感薄膜的优化

研究了4种不同光子禁带的薄膜及PFNon薄膜对Hg2+检测的影响。如图5所示，RM-IOPC400薄膜的荧光强度最高。这是由于慢光子效应使荧光增强，而蓝带边重叠的RM-IOPC400荧光最强是因为填充的有机分子属于低折射率材料，所以慢光子效应在蓝带边更为明显［20-21］。而对于RM-IOPC370薄膜，荧光几乎猝灭，是因为发射波长正好与其禁带中心位置重叠，非但没有增强荧光反而限制了荧光的传播。因此，后续实验中选择RM-IOPC400作为最佳的光子晶体传感薄膜。

图5 RM填充的不同薄膜检测5 mmol/L Hg2+的荧光强度

此外，以IOPC400为载体，填充不同量的RM溶液，研究所得薄膜检测Hg2+的荧光性质，585 nm处的荧光强度如图6所示。当填充量增加至100µL时，荧光强度达到最大。这是因为RM作为传感分子，它的量越多结合的Hg2+越多，产生的荧光产物越多，荧光强度也就越强。但随着填充量的继续增加，荧光强度有所降低，这可能是由于较多RM的填入使反蛋白石光子晶体的孔径减小，光子禁带发生移动，慢光子效应减弱，导致荧光强度降低。因此，以100µL RM溶液填充的IOPC400作为最优化传感薄膜研究汞离子的传感性能，此时RM的最佳填充量为7.52µg。

图6 不同体积的RM溶液填充的IOPC400检测5 mmol/L Hg2+的荧光强度

2.4 RM-IOPC400薄膜检测汞离子的性能及应用

首先研究了传感薄膜浸入Hg2+溶液中不同时间后的荧光光谱，以浸入5 mmol/L的Hg2+溶液为例，其在585 nm处的荧光强度随时间变化如图7所示。薄膜初始状态荧光强度极弱，而5 min后强度急剧增大，随后缓慢增大，至25 min后强度达到最大且趋于平稳，说明该薄膜与Hg2+的响应在25 min即可达到平衡。同样测试了薄膜在10 mmol/L和25 mmol/L的Hg2+溶液中不同时间的荧光强度变化，结果表明，薄膜也是在5 min内荧光强度急剧增大，而在Hg2+例子浓度为25 mmol/L时，达到平衡的时间则只需要15 min，这是由于Hg2+浓度增大，在薄膜孔隙的扩散速度增大，与RM作用生成产物的速率更快。

图7 RM-IOPC400检测5 mmol/L Hg2+后荧光强度随时间变化

通过将RM-IOPC400薄膜浸入不同金属离子的溶液中研究其荧光变化以考察该薄膜检测Hg2+的选择性，同时用各种金属离子的混合溶液检测Hg2+的抗干扰性，结果如图8A所示。RM-IOPC400薄膜只有在Hg2+存在时能够发射强的荧光，在Cu2+、Pb2+、Fe3+存在时表现出微弱的荧光，然而这些相对于检测汞离子的荧光强度可以忽略。这是由于RM与Hg2+的选择性配位作用使其具有很好的专一性检测。而薄膜在各种金属离子的混合液中仍然表现出强荧光性质，说明所构筑的光子晶体薄膜在其他离子存在的情况下仍然能够很好的检测Hg2+，具有良好的抗干扰性。

将RM-IOPC400薄膜浸入1～25 mmol/L不同浓度的Hg2+溶液中，荧光光谱如图8B所示，研究了检测Hg2+的灵敏度。荧光光谱表明，随着Hg2+浓度增大，薄膜荧光强度逐渐增强，荧光强度与浓度的关系见图8C。可知，在1～10 mmol/L范围内，荧光强度与Hg2+浓度呈良好的线性关系，相关系数R2=0.999 4；而在低浓度范围内（10～105nmol/L），荧光强度与Hg2+浓度的对数成正比，相关系数R2=0.991 5，根据标准偏差法（3σ/s，其中σ为空白样品荧光响应的标准偏差，s为校准曲线的斜率）计算得到最低检出限（LOD）为2.1 nmol/L，与文献［17］中报道的检出限0.2µmol/L相比提高了2个数量级，实现了对Hg2+的高灵敏度检测。

图8 RM-IOPC400检测Hg2+的性能

此外，将与Hg2+响应后RM-IOPC400薄膜浸入10 mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，避光放置30 min后薄膜荧光猝灭，这是由于EDTA与Hg2+更强的络合作用从RM-Hg2+的络合物中夺取Hg2+，使RM由开环形式又转变为闭环的螺吡喃式［17］，所以荧光猝灭。将薄膜交替浸入Hg2+和EDTA溶液中，荧光强度可多次可逆变化（图8D），表明该传感薄膜可以重复性使用。

3 结论

本文制备了一种罗丹明B衍生物荧光探针分子填充的SiO2反蛋白石光子晶体荧光传感薄膜，实现了对Hg2+的高效检测。所选探针分子能够与Hg2+专一配位使其螺吡喃结构的内酰胺开环从而在585 nm处发射荧光，使该薄膜能够高选择性检测Hg2+，并且不受其他金属离子的干扰；通过选择光子禁带蓝带边与荧光发射波长相匹配的光子晶体，慢光子效应极大的增强了发射的荧光，提高了检测的灵敏度，最低检出限为2.1 nmol/L，比溶液体系提高了2个数量级；此外，该传感薄膜利用EDTA与Hg2+更强的络合能力实现了检测的可逆性，使所制的传感薄膜可以重复使用。因此，所构筑的光子晶体传感薄膜实现了对Hg2+的高选择性、高灵敏、可逆性检测，为设计构筑其他金属离子传感薄膜提供了新的思路。