无创产前基因检测技术在胎儿染色体非整倍体检测中的临床应用

禤淑霞 谢小雷 陈晨 刘艳枚 林金端 李付广 潘意珍 汤巧敏 尹卫国

1997年Lo 等［1］发现孕妇外周血中存在胎儿游离DNA（cell⁃free fetal DNA，cffDNA），2008年提出应用高通量测序（Next⁃generation Sequencing，NGS）技术对cffDNA 进行检测，经生物信息学分析评估胎儿患常见染色体非整倍体风险的方法［2］，即无创产前检测技术（Non⁃invasive prenatal test⁃ing，NIPT）。2012年，美国妇产科医师学会（Amer⁃ican College of Obstetricians and Gyencologists，ACOG）声明NIPT 可用于胎儿罹患染色体非整倍体疾病的高风险人群［3］，这是国外最早明确NIPT用途的指南。在国内，2016年国家卫健委明确将NIPT 检测技术作为介于血清学筛查和羊水穿刺染色体核型分析之间的二次筛查手段，是对常规产前筛查和产前诊断技术的有益补充［4］。

随着NIPT 的深入研究及技术优化，国内外对NIPT 的临床应用共识也在不断改变、调整、细化。NIPT 应用人群从指定的唐筛高风险人群扩展到普通人群，而慎用人群中的双胎妊娠也更改为适用人群［5⁃6］。但随之而来的问题也浮现，例如NIPT 能否取代血清学筛查作为一线筛查技术，是否应用于性染色体异常（Sex Chromosome Aneuploidies，SCA）以及罕见染色体非整倍体（Rare autosomal trisomies，RATs）筛查等，甚至存在NIPT 可以代替产前诊断的误解。因此，如何更好地将NIPT 应用于不同人群的产前筛查，降低畸形出生率，是每一位产前诊断工作者面临的挑战。

本研究通过分析NIPT 检测结果，结合NIPT高风险孕妇的羊水细胞核型分析，对NIPT 低风险人群进行产前及产后随访，评价NIPT 并技术对不同染色体异常的阳性预测值（PPV），以及不同临床指征中的阳性检出率，评价NIPT 在产前筛查中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2017年10月至2021年6月在清远市人民医院行NIPT 检测的孕妇6 535 例，纳入标准：孕周12周以上，单双胎，因临床或个人要求行NIPT 在研究截止时已得知妊娠结局。排除标准：曾有染色体异常分娩史；夫妻一方有明确染色体疾病；孕妇一年内接受过异体输血；移植手术；细胞治疗或接受过免疫治疗等可能对高通量测序结果造成干扰的；胎儿B 超怀疑有异常的；各种基因病的高风险人群［4］。纳入的例数中，6 446 例为单胎妊娠，89 例为双胎妊娠；6 403 例为自然受孕，132 例为辅助生殖受孕。孕妇年龄平均（30.00±4.94）岁；孕周平均（17.20±4.19）周。所有受检者均经过充分咨询，自愿选择NIPT 并签署知情同意书。本研究经过本院伦理委员会审批通过。

1.1.1 临床指征分组

将所有孕妇按照不同指征进行分组［7］。第一组：①高龄组，即孕妇预产年龄≥35 岁。②低龄组，孕妇产龄<35 岁；第二组：①唐筛高风险组：经血清学筛查，21 三体的截断值≤270，18 三体的截断值≤350。②唐筛临界风险组：经血清学唐氏筛查，21 三体270<截断值≤1 000，18 三体350<截断值≤1 000。③唐筛单指标异常组：经血清学三联或四联筛查，AFP、β⁃HCG、uE3、PAPPA（四者任一）的MoM 值偏高或偏低；第三组：①超声软指标异常组：经B 超检测发现NT 增厚或临界性增厚、脉络丛囊肿、鼻骨偏短、胎儿生长受限、侧脑室增宽、心室强回声光点、肠回声增强等情况。②不良生育史组：曾有不良生育情况的人群。③无临床指征但要求NIPT 组：无临床指征，但孕妇自己要求做NIPT 检测的人群，其中包括未行血清学筛查、辅助生殖（IVF）及双胎人群。

1.2 试剂及仪器

胎儿染色体非整倍体（T13/T18/T21）检测试剂盒（100 人份/盒）购自杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司（国械注准：20153400461）。主要仪器包括贝瑞和康Illumina NextSeq CN500 高通量测序仪。核型分析采用以色列BI 培养基培养细胞，使用ZEISS Axio Image.Z2 全自动显微镜进行扫片分析。

1.3 检测方法

1.3.1 NIPT 检测

以血浆游离DNA 采血管（Cell Free DNA BCT）采集孕妇外周血8～10 mL，4 h 内分离血浆。取1.2 mL 血浆提取胎儿游离DNA、构建文库、定量、高通量测序及生物信息学分析，计算每条染色体的Z值；当Z值≥3 为三体高风险，当Z值<3 为三体低风险。生物信息学分析由北京贝瑞和康基因有限公司完成。

1.3.2 羊水细胞染色体核型分析

对于NIPT 检测提示胎儿存在21 三体综合征（21⁃trismy sydrome，T21）、18 三体综合征（18⁃tris⁃my sydrome，T18）、13 三体综合征（13⁃trismy sy⁃drome，T13）及性染色体异常的高风险孕妇，建议进行羊水穿刺。取羊水细胞，均分为2 管，1 800 r/min离心12 min 后取细胞悬液1.5 mL，采用平行双线分别接种，37℃培养箱中进行培养7 d，经换液、转种，约10 d 左右根据细胞生长情况收取细胞。以秋水仙碱终止羊水细胞生长、刮取细胞、低渗、预固定、固定、再固定、滴片、烤片、胰酶消化及Giem⁃sa 染色制备羊水染色体片，以ZEISS Axio Image.Z2 扫片。每个标本至少计算30 个分裂相，分析5个完整核型。

1.4 追踪随访

跟踪随访高风险孕妇的妊娠结局；对低风险孕妇，进行产前产后随访，判断有无其他异常情况或假阴性的情况出现，以分娩后无异常为阴性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析；计量资料采用（±s）表示，计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NIPT 检测结果

6 535例孕妇中共有88 例NIPT 高风险，检出率为1.35%。见表1。

表1 NIPT 筛查胎儿染色体非整倍体的检测结果［n（%）］Table 1 Detection results of fetal chromosome aneuploidy screened by NIPT［n（%）］

2.2 不同临床指征的检测率对比

各组间的阳性检出率，高龄组和低龄组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；唐筛高风险和唐筛临界风险及单指标异常比较，差异有统计学意义（P<0.05）；不良生育史和超声软指标及要求NIPT 组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 不同临床指征的NIPT 检测情况比较Table 2 Comparison of NIPT detection of different clinical indications

2.3 随访情况

所有经羊水细胞核型确诊者中，除1 例47，XYY 选择继续妊娠且分娩后新生儿无明显异常，其余均选择终止妊娠；确诊为正常核型的孕妇继续妊娠至分娩，其中2 例NIPT 提示SCA 但核型正常者，分娩后孩子分别为外耳畸形（隐耳）、卵圆孔未闭，其余均正常。NIPT 低风险孕妇的后续产检无异常，新生儿出生后无异常，未见假阴性。

3 讨论

本研究分析了6 535 例孕妇外周血样本，NIPT提示高风险的有88 例，检出率为1.35%，与文献报道（1.41%）相符［8］。其中68 例经羊水细胞分析，21 三体、18 三体、13 三体的PPV 分别为72%、83.3%、0%，低于相关国外报道（99.17%，98.24%，100%）［9］，但与国内报道的结果相近（84.21%，75%，0%）［10］。分析其原因，一方面，本研究中假阳性病例的的Z 值都处于［⁃6，6］之间，其中［⁃5，5］之间的有8 例。研究表明NIPT 真实性与Z 值的大小相关，Z 值越大，胎儿染色体非整倍体的风险越大［11］。另一方面，假阳性与孕妇自身因素如恶性肿瘤、染色体变异、拷贝数变异、母体嵌合，以及双胎消失综合征、胎盘嵌合等因素有关［12⁃13］。此外，检出的例数较少也可能造成数据差异，特别是13 三体只检出3 例。

SCA 的PPV 为40%，对于45，X 的检出率较低（3/10），结果与国内外报道的文献结果（33.3%～47%）有较高的一致性［10，14］。性染色体较常规染色体的PPV 低，可能与GC 含量的偏向性有关，可通过改进染色体内标参照方法、分析胎儿特异性甲基化DNA 比例差异，从而修正GC 含量，减小变异系数，进而提高性染色体检出率［15］。

RTAs 的PPV 约为7.14%（1/14），与文献报道（9.38%）接近［16］。RTAs 的致病性多为不明确，可能与胎盘嵌合或单亲二倍体有关［17］。因其检测的有效性差及致病性的不明确，在实际应用中，应根据以下的原则进行补充报告：①该变异有明确的致病性，有相关报道及处理方案；②对病人进行充分的遗传咨询，以免造成孕妇不必要的心理负担及增加穿刺率甚至引产率。经随访未发现假阴性。假阴性主要是由于cffDNA 浓度过低（<4%）［13，18］，在实际应用中可通过加强质控、优化NIPT 管理流程及技术［19⁃21］，加强孕期各指标的全流程监控，降低假阴性的风险。

高龄组、唐筛高风险组的PPV 和其他分组比较，差异有统计学意义。研究表明［22⁃23］，高龄产妇由于卵细胞质量下降，生殖功能减退、生殖细胞或受精卵易发生染色体畸变或不分离等原因，导致胎儿染色体异常的发生率较高，特别是21⁃三体的检出率明显增高（35.48%～45.20%）。唐筛高风险组的PPV 为1.46%，检出的9 例中只有5 例确诊，若以NIPT 为二线筛查，可大幅减少羊水穿刺的案例，避免因入侵性检测（约0.4～1%的概率）造成的流产［24］。经超声检测异常的孕妇，联合NIPT 检测，可提高胎儿染色体异常的检出率［25］。值得注意的是，NIPT 不能检测染色体结构异常，当NIPT 为低风险但超声检查为结构异常时，建议孕妇行进一步的检查或产前诊断［4］。目前也有关于NIPT 双胎妊娠和IVF 人群的应用研究［26］，其检出率也能达到70%～80%，但仍需解决cffDNA 中位值较低，取样失败率较高等问题［27⁃28］。

综上所述，NIPT 可检测全部染色体非整倍体，提高了检出率，既可作为减少侵入性的二次产前筛查，也可作为一线的产前筛查方法。但由于NIPT 存在假阳性及假阴性的情况，13号染色体的PPV较低，性染色体异常及其他染色体异常的检出也有待完善及优化。高龄及唐筛高风险人群患染色体异常疾病的风险升高，应重点关注NIPT 在此类人群中的应用。NIPT 高风险的孕妇仍需要核型分析或基因芯片分析，不能作为产前诊断的确认方法。临床应用中应根据实际情况，多种产前筛查方法联合应用，有助于及早发现罹患染色体病的胎儿，降低出生缺陷率。