基于金属有机框架材料酶的固定化策略及其应用

杜英杰，贾晓彤，唐秀明，杜占鑫，崔建东，贾士儒

(1.天津科技大学 生物工程学院 食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457; 2.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室,四川 宜宾 644000)

酶是一种具有高效性、专一性且催化条件温和及无污染等特点的生物催化剂，在食品加工、生物医药、水处理和生物能源等领域有着巨大的应用潜力[1]。然而，大多数酶是蛋白质，易受温度、pH以及重金属盐等因素的影响变性或失活，使其难以回收利用和连续化生产。固定化酶具有较好的催化特性和稳定性，可以有效提高酶的利用率。自20世纪60年代以来，随着固定化材料和酶工程领域的研究进一步发展，固定化酶技术为酶的应用[2-4]开拓了更加广阔的应用前景。

金属-有机框架(MOFs)材料是一种具有多孔结构、处于分子尺度的原位杂化型的骨架材料，由金属离子与有机配体通过配位键结合形成[5-10],由于其结构的可设计性、比表面积大、金属离子和有机配体种类的丰富性以及孔径的可控性等特性使MOF材料被广泛应用在光催化、传感以及环境修复等领域[11-17]。近年来，MOFs材料作为酶固定化的载体[8-10]受到人们广泛的关注。

1 以MOFs为载体固定化酶的一般方法

作为一种新型材料[18-19]，MOFs形成的基本原理是无机金属离子与有机配体之间通过配位键作用获得的类晶体状有机骨架结构材料。到目前为止，以MOF为载体固定化酶的方法主要包括原位固定化法、吸附法和共价结合法，其中原位包埋法又分为原位矿化法[16, 20]、共沉淀法[16]和共包埋法[16]。原位固定化法主要是利用酶蛋白分子为核心，在其周围原位生长MOF晶体，最终在酶分子周围形成稳定的MOF壳层，实现在MOF的形成过程中将酶分子原位固定化到MOF晶体中[20](图1)。其中，由于沸石咪唑酯骨架(ZIF)材料是MOF材料中一个可以在温和水相中合成的亚类，因此原位固定化方法以ZIF系列的MOF最为常见[16]。与原位包埋法不同的是，吸附法和共价结合法是预先制备MOFs载体，然后利用酶分子与MOFs材料间的相互作用(如，吸附力或共价键)将酶分子固定在MOFs表面或孔隙中[19,21]。但是，预先制备MOFs往往需要高温高压等反应条件，同时获得的MOFs材料需要进一步化学修饰才能实现酶的共价固定。此外，吸附法固定酶存在酶分子与载体之间的相互作用较弱，在一定条件下可能导致酶分子从载体上脱落，从而使固定化酶的稳定性降低等问题[21]。与吸附法相比，虽然共价法固定化酶的稳定性得到了大幅度提升，但是强共价键的形成往往会对酶分子的构象产生影响，进而导致固定化酶的表观催化活性降低[18-19]。与吸附法和共价结合法相比，原位固定法由于其具有制备简单、反应体系环境较为温和、生物亲和性高等优势，所以它更加适用于以MOFs为载体来固定化酶[16,19-21]。

图1 仿生矿化法制备的含蛋白MOFs复合物的示意[20]

近年来，采用更换MOFs的有机配体以构建新型MOFs的固定化策略逐渐受到了研究者的关注，其中，利用氨基酸、多肽等生物分子作为MOFs的有机配体替代物构造新型仿生MOFs(BioMOFs)，并进一步进行酶的固定化，从而为MOFs固定化酶带来高的酶活回收率。但是生物分子作为配体与金属离子的结合能力较弱，因此，开发高稳定性的BioMOFs作为酶的固定化载体是未来的研究方向之一[21-22]。

2 MOFs固定化酶的改进策略

利用MOFs固定酶虽然被广泛研究，但是由于MOFs本身的特性局限，所以MOFs固定化酶存在固定化效率低、酶活回收差的问题[21-23]。因此，对MOFs材料进行修饰、改造和杂化(如，利用孔径工程、表面功能化和杂化功能化等手段)并对其固定化酶的策略进行改进以获得高效的固定化方法具有较高的研究意义。

2.1 MOFs孔径工程固定策略

由于目前所报道的大部分MOFs自身的孔径一般小于2 nm，对于大多数酶分子而言难以通过吸附或扩散的方式进入MOFs的孔径，而且小的孔径也会产生较大的传质阻力，降低酶的催化效率[22-24]。早在2006年已有Cu2+和均苯三甲酸(H3BTC)合成的Cu-MOFs，利用其本身的孔道和表面电荷直接吸附固定化过氧化物酶[22]。但是由于Cu-MOF晶体本身的孔径较小造成酶的固载量较低，导致固定化酶的酶活不高。因此亟待开发具有介孔孔道的MOFs材料进行酶的固定化。

Lykourinou等[23]通过改变配体分子的长度对MOFs材料进行扩孔改进获得了具有介孔孔道的MOFs晶体，并利用吸附法固定化微过氧化物酶(图2)，由于改进的MOFs晶体中的介孔孔道与微过氧化物酶的水动力学直径恰好吻合，因此这种紧密的孔道和酶分子的贴合作用表现出了明显的限域作用，从而使底物的转化率比游离酶的增大了3倍。但是，尽管人们目前已经发现对MOFs进行扩孔有利于酶的固定化，但是由于MOFs自身是规则的晶体结构，因此很难实现MOFs的理性扩孔过程，这大大地限制了MOFs材料固定化酶的适用范围[18-19]。

图2 改性扩孔的Tb-MOFs固定化微过氧化物酶示意[23]

2.2 MOFs表面功能化固定策略

为了提高MOFs材料在固定化酶领域的应用范围，通过化学基团对MOFs表面进行功能化修饰，并利用功能化修饰的MOFs为载体进行酶的固定化[19]引起人们的关注。相对于未修饰的MOFs材料，功能化修饰的MOFs具有更多的与酶结合的共价固定化位点，因此它不仅能赋予MOFs材料更高的酶蛋白负载量，而且可以为固定化酶带来更高的稳定性。Jung等[24]利用MOFs材料配体分子上残留在MOFs材料内部或表面的羧基的可修饰性，通过共价法将酶分子结合在MOFs颗粒上，并以此方法共价固定化的脂肪酶用于手性醇的动力学拆分反应，结果发现，与游离酶相比，固定化酶的反应活性和立体选择性并没有出现明显的降低，但发现功能化修饰的MOFs固定化酶比吸附法固定化酶具有更高的固定化效率。Cao等[25]利用戊二醛修饰后的MOFs(UiO-66-NH2)对大豆环氧化物水解酶进行共价交联固定化，结果发现，尽管固定化酶的底物选择性没有出现明显的改善，但是通过氨基和交联剂交联共价固定化的方式可以获得较高的固定化效率，固定化之后的酶活回收率约88%。

虽然利用功能化修饰的MOFs来固定酶能够改善固定化酶的部分性能，但由于存在功能化修饰的过程复杂、难以掌控等问题，这在一定程度上限制了该方法在以MOFs为载体固定化酶领域的应用[26]。因此，如果能将MOFs材料的生物亲和性高、比表面积大等优势与其他材料的优势或特性相结合，将MOFs材料进行杂化形成新的材料，可能为以MOFs为载体固定化酶提供新的高效固定化策略。

2.3 MOFs杂化功能化固定策略

传统的MOFs材料存在力学稳定性差、难以回收、化学性能(如亲疏水性)不适合酶固定化等问题，在一定程度上限制了其在固定化酶领域的应用。将MOFs与一系列功能材料或者利用新型竞争性配体对传统MOFs进行杂化[27]，在保留传统MOFs材料优良性能的同时使其更适合作为酶固定化的载体。

2.3.1 配体竞争性杂化固定策略

近年来，通过采用竞争性配体对MOFs的传统配体进行杂化合成新型MOFs用于酶的固定化[28-29]受到了越来越多的关注和报道。所用的竞争性配体多为生物亲和性配体(如，氨基酸、短肽分子等)，这些生物亲和性配体的加入可以改善酶与杂化MOFs间的相互作用及其所处的微环境，在固定化过程中也可以减缓MOFs传统的有机配体对酶分子的伤害，实现简单快捷的一步固定化。Chen等[29]报道了一种新型的氨基酸作为竞争性配体进行杂化固定化的方法(图3)，以此改进MOFs固定化酶的载体晶体结构和酶分子所处的微环境，获得了较高的催化活性，同时发现，氨基酸可以促进仿生矿化过程，能够实现酶蛋白的快速封装，使MOFs具有超高的酶蛋白的固载效率。该研究证明了被包裹的蛋白质/酶不仅能很好地维持其原有酶学性质和分子构造，而且MOFs外壳结构的保护作用使酶在极端条件(如，蛋白水解剂、高温和化学变性剂)下仍保留优异的生物活性。

图3 氨基酸杂化MOF固定化酶制备示意[29]

2.3.2 磁性杂化MOF固定化酶

除了配体竞争性杂化策略外，人们也尝试将MOFs材料与金属纳米粒子、石墨烯、多孔SiO2纳米球和磁性纳米粒子等功能材料相结合，以获得优越性能的杂化MOFs[30-32]用于酶固定化。在这些杂化MOFs材料中，金属氧化物纳米粒子Fe3O4具有反式尖晶石结构、稳定的化学性质和良好的生物相容性，在食品、环境和医药等领域受到广泛关注[33-34]。磁性Fe3O4纳米粒子作为酶固定化的新型载体，具有良好的生物相容性、粒径小、比表面积大、超顺磁性、较高的载酶量及在溶液中稳定存在等优点[35]。同时，磁性粒子不仅可以通过施加外界磁场快速地从反应体系中分离出来，促进酶的有效回收和循环利用，还可以与多种材料复合，利用这些复合材料独特的物理或表面特性提高酶的固定效率，解决单一材料在固定化酶领域所存在的问题[36-38]。

Wang等[37]研发了一种无表面活性剂、经济和绿色的高分散磁性核/壳复合微球(Fe3O4@MIL-100(Fe))，这种微球具有合适的孔径(7.07 nm)、高比表面积(137.27 m2/g)和高磁化强度(49.67 A/m)的特点。将假丝酵母脂肪酶固定在磁性核/壳复合微球上(图4)后进行了催化反应，结果发现，固定化酶在65 ℃下水解橄榄油6 h后仍保持65%左右的初始酶活，在连续10次催化运行后，固定化酶的残余酶活仍保持初始酶活的60%。

图4 Fe3O4@MIL-100(Fe)磁性核/壳复合微球固定化脂肪酶的制备示意[37]

3 MOFs固定化酶的应用

3.1 食品领域

随着生活水平的不断提高，消费者对食品安全越来越重视，准确有效地分析食品中的有害成分是食品安全领域研究的重要问题[39]。在众多检测技术中，磁性纳米粒子杂化MOFs固定化酶作为一种新的生物酶检测器已被证实是检测食品安全性的合适方法[40]。例如，Wang等[41]开发了基于磁性沸石咪唑骨架-8(Fe3O4@ZIF-8)的简易磁性固相萃取技术，Fe3O4@ZIF-8与高效液相色谱联用为同时测定塑料包装饮料和食品中的聚合物添加剂提供了一种有效的富集和测定方法。

3.2 医药领域

固定化酶可以作为疾病体外检测的检测器，或用于对体内病灶进行药用酶或蛋白等的靶向递送或缓释辅助治疗。Zhao等[42]将抗体蛋白或药用酶蛋白通过MOFs固定化后作为靶向催化剂运送进体内，实现了负载蛋白的靶向催化或者定点释放。另外，与其他纳米材料相比，MOFs材料的低生物毒性使MOFs固定化酶在生物医药领域的应用具有无法替代的优势。

3.3 环境保护领域

随着环境问题和污染的日趋严重，污染物的检测与防治受到了世界各国的关注并成了重点研究领域[5, 43-44]，其中，抗生素滥用所造成的污染已严重威胁生态环境和人类健康，迫切需要制定有效的抗生素残留降解和处置策略[30, 44]。Yang等[43]采用自组装法将酰胺酶固定在ZIF-8中(β-lactamase@ZIF-8)，并采用高效液相色谱-质谱联用技术研究了β-lactamase@ZIF-8多孔材料降解青霉素的催化性能，得到良好的结果，这为消除水环境中青霉素残留提供新的策略。

4 总结和展望

本文介绍了近年来已报道的MOFs固定化酶常用的合成方法，分析了这些方法的优缺点以及改进策略。针对MOFs固定化酶的固定化效率和催化剂稳定性较差的问题，提出利用孔道工程改变MOFs孔道的内部环境，或者通过扩孔以获得更高的固定化效率和更广的酶种类适用范围；通过MOFs后修饰的固定化方法改变MOFs与酶分子的接触方式从而获得稳定性更高的催化剂；利用杂化功能化固定策略为MOFs固定化酶带来新的物化特性。在这些策略中，对MOFs杂化功能化固定策略可能会成为酶的固定化领域新的研究重点，但是对MOFs杂化材料与酶分子的相互作用关系，尤其是材料对酶分子结构的影响规律尚需进一步研究。

总之，在MOFs中杂化其他材料或分子进行功能化改进后，使得杂化材料功能化的固定化酶成为更适合工业化应用的候选催化剂。相信通过国内外学者的努力，具有大比表面积的杂化材料可以在生物催化领域，甚至是在药物传递、催化和环境保护领域得到越来越广泛的应用。