时间分辨荧光免疫层析法同时定量检测粮食中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素

张少波，邓常继，张海涛，朱启思

（1. 广东省粮食和物资储备保障中心，广东 广州 510050；2. 广东省粮食科学研究所，广东 广州 510050；3. 江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏 无锡 214000）

粮食在生产、贮存、运输等过程中，受气候、季节、加工不当等因素影响，极易发生霉变而产生霉菌毒素[1]。全球每年约有25%的粮食受到霉菌毒素的污染，造成的经济损失达数千亿美元[2]。我国同样遭受严重的霉菌毒素污染问题，每年因此造成的粮食损失高达110亿kg[3]。更为严重的是，霉菌毒素可通过饲料或食品进入人和动物体内导致中枢神经系统、免疫系统、生殖系统等多系统器官的损伤[4]。

霉菌毒素种类繁多，其中玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）是粮食中最常见的2种霉菌毒素。玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，主要由禾谷镰刀菌产生[5]，具有生殖发育毒性、免疫毒性和基因毒性[6]，被FAO和WHO确定为最危险的自然发生的食品污染物之一。呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，主要由镰刀菌属产生的有毒代谢产物，具有很强的免疫抑制和细胞毒性，被欧盟列为三级致癌物[7]。近年来，ZEN和DON超标事件屡见报道，引起社会广泛关注。受霉菌毒素污染的粮食尚无有效的去毒方法，因此，加强粮食中霉菌毒素的监测成为降低其危害的重要途径。时间分辨荧光免疫层析技术因其灵敏度高、检测速度快、结果稳定等优点，成为霉菌毒素检测领域的研究热点，并在食品检测行业得到应用[8]。

时间分辨荧光免疫分析法是一种微量分析方法，利用免疫反应的高度特异性和标记示踪物的高度灵敏性相结合而建立的一类非放射性的检测技术，是目前最灵敏的超微量分析技术之一[9]。目前，该技术的应用主要集中在单个霉菌毒素的快速定量检测，多种毒素特别是ZEN、DON的同时检测报道较少。本文拟建立同时测定粮食中ZEN和DON含量的时间分辨荧光免疫层析定量检测方法，为其进一步推广使用提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

SW-2型时间分辨荧光免疫层析定量检测仪、ZEN和DON时间分辨荧光免疫层析定量检测卡：江苏省苏微微生物研究有限公司；AL204-IC型电子天平：梅特勒-托利多国际股份有限公司；3310型盘式实验粉碎磨：波通瑞华科学仪器有限公司；Multi Reax型旋涡混匀器：德国Heidolph公司；MINI-7K型微型离心机：杭州米欧仪器有限公司；Milli-Q型超纯水仪：美国密理博公司；20 ~ 200 μL和100 ~ 1 000 μL单道可调移液器：德国Eppendorf公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司；ZEN、DON免疫亲和柱、样品稀释液：江苏省苏微微生物有限公司；玉米全粉中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮成分分析标准物质[GBW（E）100383]、全麦粉中玉米赤霉烯酮成分分析标准物质[GBW（E）100384]、糙米粉中呕吐毒素成分分析标准物质[GBW（E）100608]、ZEN标准品[GBW（E）100301]及DON标准品[GBW（E）100304]：国家粮食和物资储备局科学研究院。

1.2 试验方法

1.2.1 检测原理

玉米赤霉烯酮/呕吐毒素时间分辨荧光免疫层析定量检测二联卡运用竞争抑制免疫层析的原理，样本中若含有ZEN、DON，则在侧向移动的过程中会与荧光微球标记的特异性单克隆抗体反应，抑制抗体和NC膜检测线上ZEN-BSA与DON-BSA偶联物的结合。随着样本中ZEN与DON含量的升高，结合于检测线上的抗体量减少，相应的检测线荧光强度也随之变弱。使用专用时间分辨荧光免疫层析检测仪读数，可定量地测出样本中ZEN与DON的含量。

1.2.2 样品前处理

准确称取2.00 g粉碎样品（稻谷样品需垄谷）于50 mL离心管中，加入10 mL 60%甲醇水至50 mL离心管中，涡旋提取2 min，7 000 r/min离心5 min，取上清液。

1.2.3 样品检测

测试前，将未开封的检测卡及试剂平衡至25 ℃。将检测卡平放，用移液器定量吸取100 μL上清液加入500 μL样本稀释液，反复吸打5次以充分混匀，吸取100 μL此混合液垂直滴加于加样孔中，于20 ~ 25 ℃下反应10 min后，将检测卡放入时间分辨荧光免疫层析检测仪中检测；在仪器感应区中放置对应的标准曲线智能卡，在主界面的“测量”菜单中点击读取智能卡后，点击“样品测量”进行检测仪器读数完成后会自动计算出被检样本中的ZEN和DON含量，可选择储存及打印结果。

若环境温度不在20 ~ 25 ℃范围内，则需在测样前进行一次校准，即取100 μL DON-ZEN标准溶液点卡反应10 min，再将此卡放入仪器中，在仪器主界面的“测量”菜单中点击“标准测量”按钮，进行校准；若环境温度在该范围内，则无需校准。

1.2.4 检测方法的评价

（1）线性范围与定量曲线：DON标准品与ZEN标准品用50%甲醇定容配制成1 000 ng/mL的标准储备溶液；采用0.4%的吐温-PBS（pH 7.2，0.01 mol/L）稀释成0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL的标准工作溶液。分别取100 μL加至层析卡的样品孔中，每个浓度设置3个平行，由低浓度到高浓度进行检测，记录时间分辨荧光仪检测T1、T2线荧光强度与C线荧光强度，计算T1/C与T2/C值。以标准工作溶液浓度的自然对数值（InC）为横坐标，以各浓度标准液的T/C值与0 ng/mL标准液的T0/C0值的比值所得百分比为纵坐标，制图、选择线性范围，并建立定量曲线。

（2）检出限与定量限：取20组独立的阴性玉米样品（ZEN、DON均未检出），用玉米赤霉烯酮/呕吐毒素时间分辨荧光免疫层析二联卡对其进行检测。检出限（LOD）等于20次测定结果的均值（）加上3倍的标准标准差（s），即＋3s；定量限（LOQ）等于＋10s。

（3）准确度：按照1.2.2的前处理方法，在阴性玉米或小麦样品中分别加入低、中、高浓度的ZEN/DON标准溶液，测定加标回收率，评估方法的准确度。

（4）精密度：分别选择接近于方法定量限、标准最高允许限量和本方法线性范围内适当含量水平的3种浓度的ZEN-DON标准工作溶液，每个浓度水平10次重复试验，计算批内变异系数（CV）。

（5）批间稳定性：采用接近于标准最高允许限量的ZEN-DON标准工作溶液，测试10个批次的二联卡，每个批次测定3次，批内测定取平均值，计算二联卡批间变异系数。

（6）与液相色谱法的对比试验：取不同基质不同浓度的标准物质，先用液相色谱法测定，再使用时间分辨荧光免疫层析法测定，并对比验证。

2 结果与讨论

2.1 线性范围与定量曲线

由图1、图2可以发现，横坐标采用的是浓度的自然对数，通过绘制得到的依然是平滑的S曲线，这与免疫竞争得到的曲线是一致的。同时，DON在0.5 ~ 50.0 ng/mL的质量浓度范围内，该段曲线接近于直线，分析其线性回归相关系数R2= 0.990 1；ZEN在0.2 ~ 5.0 ng/mL的质量浓度范围内，同样为一段接近于直线的曲线，分析其线性回归相关系数R2= 0.992 2。由此，选定DON定量曲线的线性范围为0.5 ~ 50.0 ng/mL，ZEN定量曲线的线性范围为0.2 ~ 5.0 ng/mL，并以此作为以下试验的线性浓度，建立定量曲线如图3、图4所示。

图1 不同浓度DON标准工作溶液（0.2～50.0 ng/mL）的平滑曲线

图2 不同浓度ZEN标准工作溶液（0.2～50.0 ng/mL）的滑曲线

图3 DON定量曲线

图4 ZEN定量曲线

2.2 检出限和定量限

由表1可知，ZEN的检出限和定量限分别为7.92、15.10 μg/kg，DON的检出限和定量限分别为71.9、146.1 μg/kg，满足GB 2761—2017规定的粮食样品ZEN、DON的限量要求。

表1 方法的检出限和定量限（n=20） μg/kg

2.3 准确度

根据GB 2761—2017标准限量，设定3个涵盖低、中、高浓度的加标回收试验，其中ZEN加标浓度分别为30、60、120 μg/kg，DON加标浓度分别为500、1 000、1 500 μg/kg，用二联卡重复测定6次，结果如表2、表3所示。可知，本方法加标回收率在91% ~ 106%，相对标准偏差小于15%，满足检验的要求。

表2 ZEN加标回收率试验结果

表3 DON加标回收率试验结果

2.4 精密度

参照LS/T 6112—2015附录A的方法，配置3种浓度的ZEN/DON标准工作溶液，每个浓度水平重复测定10次，计算二联卡批内变异系数，结果见表4、表5。可知，ZEN批内变异系数在8.02% ~ 12.53%，DON批内变异系数在7.11% ~ 14.03%，均小于20%，说明该方法精密度良好。

表4 ZEN精密度试验结果（n=10）

表5 DON精密度试验结果（n=10）

2.5 批间稳定性

配置ZEN/DON标准工作溶液，按1.2.4（5）进行测试，结果表明（表6），ZEN批间变异系数为13.53%，DON批间变异系数为11.17%，均小于20%，说明该方法批间差异不大，稳定性良好。

表6 批间稳定性试验结果（n=10）

2.6 与液相色谱法的对比试验

分别采用液相色谱法和时间分辨荧光免疫层析法检测玉米全粉中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮成分分析标准物质、全麦粉中玉米赤霉烯酮成分分析标准物质、糙米粉中呕吐毒素成分分析标准物质，重复测定5次，将两种方法的检测结果进行线性回归分析，结果如图5、图6所示。两种方法的ZEN和DON检测结果线性回归系数（R2）分别为0.991 5和0.990 5，且所测结果均在标准物质的标准值内。说明在不同的粮食基质中，时间分辨荧光免疫层析法检测值与液相色谱法检测值较为一致，结果准确有效。

图5 HPLC法与时间分辨荧光免疫层析法测定ZEN的相关性

图6 HPLC法与时间分辨荧光免疫层析法测定DON的相关性

3 结 论

本试验建立了同时测定粮食中ZEN和DON含量的时间分辨荧光免疫层析定量检测方法。该法对粮食中ZEN、DON的检出限分别为7.92、71.90 μg/kg，定量限为15.10、146.10 μg/kg，线性范围为0.2 ~ 5.0、0.5 ~ 50.0 ng/mL，不同水平的加标回收率在91% ~ 106%，批内与批间变异系数均小于20%。选取不同基质的标准质控样品进行测试，本试验建立的方法与液相色谱法检测结果具有较好的相关性，且在所测标准质控样品的标准值范围内。该方法的准确度和精密度满足使用要求，且具有简便、快速、经济等特点，适用于玉米、小麦、稻谷等粮食的ZEN和DON快速定量检测。