4种不同方法在献血者梅毒检测中的应用*

陈邦锐，许婷婷，张 红，乐 淼

武汉血液中心，湖北武汉 430030

梅毒是由苍白密螺旋体感染引起的一种常见性传播疾病，可导致心血管、神经系统、皮肤等全身性病变，近年来其发病率呈上升趋势。国内采供血机构的血液因梅毒阳性的报废率也在上升[1]，在血液报废的传染类指标中，梅毒阳性报废率已经超过丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性的报废率。有研究报道中国的部分地区无偿献血者梅毒阳性率为0.56%～0.59%[2]，梅毒感染已成为威胁血液安全的重要因素之一，而实验室对梅毒的准确检测是治疗和控制梅毒传播的一个前提。目前，酶联免疫吸附试验(ELISA)因检测成本低，灵敏度高，操作方法简单成熟，且可以实现自动化、批量化检测等优点，在采供血机构各实验室已成为梅毒血清学检测的主要方法之一。在采供血机构实验室中，同一项目的ELISA检测采用两个不同厂家的试剂同时进行检测，结果中就有双试剂阳性和一定比例的单试剂阳性，根据《血站质量管理规范》要求，凡出现梅毒阳性结果均予以屏蔽献血资格。因此，笔者认为有必要对采用ELISA进行梅毒初筛阳性的献血者进行梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)、金标试纸条、快速血浆反应素试验(RPR)检测，并对不同方法的检测结果进行比较，目的是为了有效减少血液资源浪费，同时也为献血者咨询提供更好的服务，减少献血者的心理负担和不必要的纠纷，也为以后的献血者归队提供一定数据支持。

1 材料与方法

1.1标本来源 2018年1—6月本中心采集的78 997份献血者标本中经ELISA检出的331份梅毒阳性标本，包括双试剂阳性标本227份、单试剂阳性(包括灰区值，S/CO≥0.70)标本104份。

1.2仪器与试剂 全自动酶免分析仪FAME，型号24/20(瑞士 HAMILTON)；加样仪STAR，型号8CH(瑞士 HAMILTON)；洗板机HYDROFLEX(奥地利 TECAN)；酶标仪SUNRISE(奥地利 TECAN)；离心机ST40R(德国 Thermo Fisher)；梅毒自动混旋仪TL-2000B(中国 天力)。厦门新创梅毒螺旋体抗体检测试剂盒(试剂A，批号2018047512、2018067518)；广州丽珠梅毒螺旋体抗体检测试剂盒(试剂B，批号2018010208、2018041008)；上海科华梅毒螺旋体抗体检测试剂盒(试剂C,批号201708251)，在采样检测期间，先以新创和科华试剂组合使用，后期更换为新创和丽珠试剂组合使用。日本富士瑞必欧株式会社TPPA试剂，批号VN81025；上海科华RPR试剂，批号20181005；厦门新创梅毒金标试纸条，批号2018113351。所有试剂均批检合格，并在有效期内使用。

1.3方法 收集双试剂阳性标本、单试剂阳性重复检测仍为阳性标本，同时进行TPPA、金标试纸条、RPR检测。TPPA检测时严格按照试剂盒说明书进行操作。TPPA步骤如下：室温条件下在U型板上用稀释液依次倍比稀释标本，然后分别加入未致敏和致敏明胶颗粒，振荡混合30 s，加盖后于室温(15～30 ℃)下水平静置。2 h后，在观察镜上记录并观察其反应图像，进行测定结果的判定。 RPR步骤如下：在卡片上滴加一滴试剂，抹匀，然后加50 μL标本，卡片旋转8 min后观察结果。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行数据处理及统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

104份ELISA单试剂阳性标本进行TPPA、金标试纸条、RPR检测，仅3份标本TPPA呈阳性，金标试纸条检出1份阳性，RPR检出1份阳性，其余为阴性，见表1。227份ELISA双试剂阳性标本进行TPPA、金标试纸条、RPR检测，有209份TPPA呈阳性，梅毒ELISA检测结果和TPPA确证结果比较，差异有统计学意义(χ2=246.37，P<0.01)。ELISA双试剂阳性的标本进行TPPA、金标试纸条、RPR检测，3种方法均阳性39份；TPPA、金标试纸条均阳性，RPR阴性153份；TPPA阳性，金标试纸条、RPR阴性17份；3种方法均阴性18份。ELISA双试剂检测的S/CO值与TPPA比较见表2，当S/CO值≥5.00时，ELISA与TPPA符合率很高，当S/CO值<5.00时，二者才略有差异；ELISA单试剂检测的S/CO值与TPPA比较见表3。

表1 ELISA单试剂阳性标本3种方法联合检测呈阳性的3份标本结果

表2 ELISA双试剂阳性S/CO值与TPPA对应情况(n/n)

表3 ELISA单试剂阳性S/CO值与TPPA对应表(n)

3 讨 论

TPPA是目前公认的梅毒确证方法，具有很高的检测效能，常用于梅毒初筛试验后的确证检测，检测的是梅毒特异性抗体，该抗体可终身存在体内，即使患者被治愈后仍然可以存在；RPR是检测梅毒患者血液中非特异性的心磷脂抗体，多用于梅毒病情发展判断和疗效观察，但在感染早期检出效能低，且治愈后该抗体会逐渐消失；梅毒金标试纸条检测快速简单，且对环境要求不高，适合采血现场使用，但灵敏度不高，仅用于献血前的初筛；梅毒ELISA具有试剂稳定性好、价格适宜、灵敏度较高、操作简单、可实现批量自动化检测等优点，因此在采供血机构被广泛使用。目前行业内多采用两个不同生产厂家的ELISA试剂同时检测梅毒特异性抗体。ELISA试剂的方法学多为双抗原夹心法，该方法灵敏度较高，因而在实际检测中不可避免地会有假阳性存在[2-3]，同时由于方法学上的缺陷及包被原料的差异，也存在一定的漏检风险[4]。比较梅毒ELISA试剂呈反应性的331份标本的TPPA、金标试纸条、RPR检测结果，单试剂阳性的104份标本中仅有3份TPPA确证为阳性，有101份确证为阴性；双试剂阳性的227份标本中有209份TPPA确证为阳性，18份确证为阴性，ELISA与TPPA检测结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。以TPPA作为金标准，则ELISA存在较多假阳性结果，统计梅毒ELISA试剂检出的不合格标本，TPPA总的确证阳性率仅为64.05%(212/331)，但这一结果仍高于胡晓玉等[5]报道的确证阳性率57.24%，以及李玲等[6]报道的确证阳性率38.87%。但是本着安全第一，保护用血者安全的角度考虑，这部分筛查结果为假阳性的血液亦做报废处理，献血者资格采取永久屏蔽的策略。这不仅造成血液资源的浪费，还会造成献血者资源的流失，而且梅毒假阳性结果给献血者带来了一些困扰，甚至导致家庭矛盾，产生一定的精神压力[7]。

本研究结果显示，梅毒ELISA双试剂阳性检测结果的TPPA确证阳性符合率高达92.07%(209/227)，低于王艳彬等[8]在文献中报道的93.82%；而单试剂阳性检测结果的(包括灰区标本)TPPA确证阳性符合率为2.88%(3/104)，低于王艳彬等[8]在文献中报道的7.44%，这得益于本机构工作人员良好的操作能力，以及优良的试剂选择。血站系统为了提高血液安全性，均采用灵敏度高的ELISA筛查试剂，在实际工作中允许存在一定假阳性结果。另外，根据WHO发布的《筛查献血者血液经输血传播感染的建议书》可知，要求血站开展筛查的同时，也建议开展确证试验，分别用于献血者筛查和献血后服务管理。选择灵敏度、特异度高的ELISA试剂，并且对ELISA检测不合格的标本进行梅毒确证试验，不但可以提高梅毒检出率、保证血液安全，而且可以减少因为假阳性结果给献血者带来的不必要麻烦，减少献血者的流失；采供血机构咨询人员也可以更好地开展咨询工作，为献血者做好解释、回访服务。根据本研究数据，笔者发现ELISA双试剂阳性的结果S/CO值与TPPA具有很高的符合率，TPPA检出率与S/CO值呈正比，而ELISA单试剂阳性的标本TPPA确证阳性率极低，且S/CO值与TPPA不具有相关性，因此，笔者建议目前仅针对ELISA单试剂阳性标本进行TPPA确证，这样可以有效减少工作量，提高效率[9]，即对于梅毒ELISA单试剂阳性且TPPA确证阳性结果的献血者必须进行屏蔽处理；对于梅毒ELISA单试剂阳性而TPPA确证阴性献血者可纳入献血者归队人群管理，待献血者满献血间隔期后重新进行采样检测，再次进行梅毒ELISA及TPPA确证，结果若均为阴性，则献血者可归队，结果仍为阳性者作屏蔽处理。这样既可以最大限度地保证血液质量，也可以减少因试剂的假阳性结果给献血者造成的心理负担，缓解采供血机构与献血者之间的不必要矛盾，促进采供血事业的可持续健康发展。

本研究结果还显示，单试剂检测可能存在漏检，在确证为阳性的标本中，有3份标本ELISA单侧阳性标本其对侧检测结果小于cut off值(0.7)，其 S/CO值别为0.50、0.04、0.40，说明ELISA实行双试剂检测还是有必要的，同时笔者准备下一步对该3份标本及献血者进行追踪，做回访调查分析。

在TPPA梅毒确证为阳性的标本中梅毒金标试纸条检出率高达91.04%(193/212)，说明梅毒金标试纸条与TPPA具有较高的符合率[10]，如果采用梅毒金标试纸条则可以有效降低血液报废率，减少血液资源的浪费，建议在献血前采用梅毒金标试纸条进行初筛，用来在献血前淘汰一部分梅毒真阳性感染者。同时，梅毒感染既有既往感染，也有现症感染，即TPPA+/RPR+为现症感染，TPPA+/RPR-为既往感染，本研究中现症感染占18.87%(40/212)，多数为既往感染人群，因为梅毒感染是可以通过有效药物治疗的，且可治愈，但其特异性抗体会长期存在[11]。实际工作中，存在一部分现症感染者来献血，可能是在发生危险行为后，为了自我体检而来献血，这为献血者招募工作带来了挑战，要求工作人员进一步提高对献血者献血前的问询水平，同时针对梅毒现症感染者在回访咨询时可以告知其做进一步的检测与治疗，以免造成梅毒感染者的家庭内传播及社会上传播。

综上所述，血液安全永远是第一位，血液检测方法也要不断优化，应该是全流程覆盖，包括献血前检测、献血后常规检测及常规检测后的结果分析。因此，可以采用不同检测方法与技术，即在献血之前有必要进行梅毒金标试纸条检测，淘汰一部分梅毒感染者，这可以在一定程度上减少因梅毒阳性而导致的血液报废；在常规检测中要选择灵敏度和特异度较高的ELISA试剂，不断优化试剂组合，尽量减少假阳性的发生,减少不必要的血液报废；同时在采血之后针对梅毒ELISA单试剂阳性标本,通过TPPA确证试验，有效鉴别出假阳性，为献血者结果咨询提供准确答复，减少献血者心理负担和精神困扰，提高公众对无偿献血的信任度，为献血者提供更好的精细化服务；将不同的检测方法应用在血液检测的不同阶段，提高采供血机构的血液安全和服务质量，甚至可以为以后构建梅毒初筛反应性献血者归队策略做好数据支持。目前全国采供血机构还没有形成统一的梅毒初筛反应性献血者归队指南，即ELISA任意1种试剂有反应性均判为不合格，屏蔽献血资格，而在国外，在明确梅毒治愈1年后，即便特异性抗体(如ELISA检测)呈反应性，若非特异性抗体(RPR检测)无反应性，则献血者仍然可以献血。最近几年国内大多数血站尝试归队的梅毒初筛反应性献血者人群仅仅针对TPPA阴性或不确定结果，相信随着更多实验室的参与，更多数据的积累，我国的献血者归队策略将更加完善。