CDKN2BAS基因多态性与川崎病的关联性研究*

张 驰，申 琳，易 璐，胡 爽，庄晓琪，左袁博教，黄利华，李卓颖，杨作成

中南大学湘雅三医院儿科，湖南长沙 410013

川崎病是一种急性、全身性的血管炎性疾病，也称为皮肤黏膜淋巴结综合征，病因不明，易发人群多为5岁以下的婴幼儿[1]，少数严重者可引起冠状动脉病变。目前，川崎病的发病机制尚不明确，多认为是人体受各种病原微生物侵袭造成的免疫损伤[2]。川崎病是儿童发生后天性心脏病的重要原因之一[3-5]。研究表明，长链非编码RNA(lncRNA)可以通过多种方式参与基因调控来达到影响人体生长、发育、代谢及疾病的目的，而定位于INK4位点上的lncRNA则称作CDKN2BAS。CDKN2BAS即编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B反义RNA，可以调控多种靶基因，在炎性反应、免疫疾病和心血管疾病等方面发挥着重要作用。目前，已有研究发现CDKN2BAS基因及其多态性与冠心病、动脉粥样硬化及2型糖尿病等疾病有关，但目前缺乏CDKN2BAS基因与川崎病发病关系的相关报道。本研究采用病例对照的方法来探讨CDKN2BAS基因rs1333049位点及rs4977574位点基因多态性与川崎病发病及合并冠状动脉损伤(CAL)的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 按照川崎病的诊断标准，选择2016—2019年本院收治的汉族川崎病患儿100例纳入研究组，所有患儿入院前无阿司匹林和丙种球蛋白(IVIG)用药史。根据美国心脏协会定义的冠状动脉扩张Z值大小及心脏彩色多普勒超声检查结果，计算Z值[1]，将Z值<2的患儿纳入川崎病无冠状动脉损伤组(KD-NCAL组)，Z值≥2的患儿纳入川崎病合并冠状动脉损伤组(KD-CAL组)。KD-CAL组25例，KD-NCAL组75例。研究组中男58例，女42例，比例为1.38∶1.00；平均年龄(34.17±24.2)个月。另外选择同期本院体检健康婴幼儿100例纳入对照组，既往无川崎病病史，排除风湿性疾病、心血管疾病及感染性疾病等。对照组中男49例，女51例，男女比例为0.96∶1.00，平均年龄(42.38±28.3)个月。对照组与研究组性别比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1标本采集 在征得研究对象监护人同意后，用含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)的一次性采血管采集所有研究对象2 mL静脉血，置于—80 ℃冰箱内保存。

1.2.2基因组DNA提取 取静脉血标本，应用 Promega DNA提取试剂盒，按说明书要求提取DNA，用 NanoDrop ND-2000C 50分光光度计进行纯度和浓度的检测，存于—80 ℃的冰箱中备用。

1.2.3多态性检测 采用聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)检测CDKN2BAS基因多态性，通过GenBank检索到CDKN2BAS基因序列，引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成：rs1333049上游引物为 5′-CTTGAGACTAGTATACCAATCATACTCCT-3′，下游引物为5′-TACATATGTGTTAATGACA-3′；rs4977574上游引物为5′-CATGCTTTCTGAAACAACACG-3′，下游引物为5′-TAATGGAGGTGTGGTCAGCA-3′。PCR反应体系为15.0 μL，包括制好的模板DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶(MixⅡ) 9.0 μL，引物各0.5 μL，去离子水加至15.0 μL。rs1333049位点PCR扩增反应条件：(1)在 94 ℃下对样品进行5 min的预变性1次；(2)按以下步骤进行35次循环，94 ℃下变性30 s，降至60 ℃退火30 s，温度提升至72 ℃进行40 s延伸；(3)最后5 min延伸，4 ℃保存。rs4977574位点PCR扩增反应条件：(1)在 94 ℃下对样品进行5 min的预变性1次；(2)按以下步骤进行35次循环，94 ℃下变性40 s，降至60 ℃退火40 s，温度提升至72 ℃进行40 s延伸；(3)最后5 min延伸，4 ℃保存。对扩增产物染色后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，可在紫外灯下照相后观察结果并记录电泳图谱，初步判定扩增成功与否[6]。PCR 扩增产物送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行基因测序并用 Chromas软件分析测序结果。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行数据处理及统计分析，基因型和等位基因频率以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。对研究组和对照组基因型及等位基因频率进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律验证，以确定两组是否符合遗传平衡。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CDKN2BAS基因rs1333049位点及rs4977574位点多态性检测 CDKN2BAS基因rs1333049位点PCR扩增片段大小为313 bp，rs4977574位点PCR扩增片段大小为411 bp，使用1%琼脂糖凝胶电泳分离(图1)。将 PCR 所得产物进行基因测序，显示rs1333049位点存在CC、CG、GG 3种基因型(图2)；rs4977574位点存在AA、AG、GG 3种基因型(图3)。对研究组和对照组进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律验证后，研究组与对照组CDKN2BAS基因rs1333049位点基因型频率分布符合遗传平衡定律(χ2=5.989，P>0.05；χ2=1.588，P>0.05)；研究组与对照组CDKN2BAS基因rs4977574位点基因型频率分布符合遗传平衡定律(χ2=0.430，P>0.05；χ2=0.745，P>0.05)。

注：A为 rs1333049位点；B为 rs4977574位点。

注：A为CC纯合子； B为CG杂合子； C为GG纯合子。

注：A为AA纯合子； B为AG杂合子；C为GG纯合子。

2.2CDKN2BAS基因位点多态性的变化

2.2.1川崎病患儿CDKN2BAS基因rs1333049位点多态性的变化 研究组与对照组CDKN2BAS基因rs1333049位点多态性C、G等位基因频率和CC、CG、GG基因型频率的分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。KD-CAL组与KD-NCAL组CDKN2BAS基因rs1333049位点多态性的C、G等位基因频率和CC、CG、GG基因型频率的分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 研究组和对照组CDKN2BAS基因rs1333049位点多态性的等位基因频率与基因型分布比较[n(%)]

表2 KD-CAL组与KD-NCAL组CDKN2BAS基因rs1333049位点多态性的等位基因频率与基因型分布比较[n(%)]

2.2.2川崎病患儿CDKN2BAS基因rs4977574位点多态性的变化 研究组与对照组CDKN2BAS基因rs4977574位点多态性A、G等位基因频率和AA、AG、GG基因型频率的分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。KD-CAL组与KD-NCAL组CDKN2BAS基因rs4977574位点多态性的A、G等位基因频率和AA、AG、GG基因型频率的分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表3 研究组与对照组CDKN2BAS基因rs4977574位点多态性的等位基因频率与基因型分布比较[n(%)]

表4 KD-CAL组与KD-NCAL组CDKN2BAS基因rs4977574位点多态性的等位基因频率与基因型分布比较[n(%)]

3 讨 论

川崎病好发于亚裔婴幼儿，发病年龄主要集中在6月龄至5岁[5]，可导致全身性中小血管炎症。川崎病的并发症主要是CAL，严重时甚至可导致冠状动脉瘤发生。在早期未使用大剂量IVIG的情况下，每4例患儿中就有1例会发展为冠状动脉瘤；而使用IVIG后，发病风险则降至4%左右[7]，但有10%～20%的患儿对IVIG不敏感[8]。川崎病的发病机制尚未完全明了，有研究发现，某些基因的SNP位点及其多态性与川崎病发病有关联性，如白细胞介素(IL)-1β基因-31 T/C位点及PPIA基因rs17860041 A/C位点等基因的多态性与川崎病的发病存在相关[6,9]。

CDKN2BAS基因是位于人类染色体9p21区段上的CDKN2A/B基因丛转录的lncRNA，该基因定位于p15/CDKN2B-p16/CDKN2A-p14/ARF基因簇的INK4位点，全长126.3 kb，可沿蛋白质编码反义转录，形成长3 834 bp的mRNA。该基因通过不同转录剪接方式剪接形成约20种线性转录子及环形转录子，调控细胞增殖和凋亡[10-13]，从而参与多种疾病的发病，包括黑色素瘤、肝癌、鼻咽癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤，以及动脉粥样硬化、2型糖尿病等。在亚洲人群中，CDKN2BAS基因rs4977574位点携带G等位基因可能增加患冠心病、心肌梗死的风险[14]；rs1333040、rs1333049和rs2383207位点多态性与东亚人群冠心病的患病风险显著相关[15]。CDKN2BAS基因rs1333049 C>G与急性心肌梗死患病风险显著相关。同时CDKN2BAS基因rs2383207位点也与冠心病患病风险显著相关[16]。另有研究发现，CDKN2BAS基因rs2184061位点AA基因型增加了45岁以上人群动脉粥样硬化性脑梗死的发病风险，携带C等位基因则会明显降低发病风险；同时，rs7044859位点的AA基因型同样会增加45岁以上人群动脉粥样硬化性脑梗死的发病风险[17]。一项胶质瘤的研究发现，CDKN2BAS rs2151280 A>G与胶质瘤发生风险升高有关，而rs1136410的GG基因型有利于无进展生存和整体生存，rs1136410 A>G和rs7763881 A>C更有利于胶质瘤患者的整体生存[18]。一项关于胰腺癌的研究发现，携带rs1537373 TG/GG基因型的个体比携带TT基因型的个体表达更高水平的CDKN2BAS，从而赋予其胰腺癌的易感性[19]。研究发现CDKN2BAS在多种炎症及免疫疾病发病过程中起到了重要的作用，如SONG等[20]对大鼠冠状动脉粥样硬化模型进行研究，发现环状CDKN2BAS在加重血管内皮细胞炎性反应方面起着重要作用，提示降低CDKN2BAS表达可能对动脉粥样硬化患者的治疗有保护作用。JARINOVA等[21]发现，CDKN2BAS基因可以调控下游内皮细胞的炎性反应。这些研究提示CDKN2BAS基因可能在川崎病的发病过程中参与免疫炎性反应，导致川崎病血管炎的发生。但较少见CDKN2BAS基因多态性与川崎病关联性的报道。

本研究对研究组与对照组，KD-CAL组与KD-NCAL组的CDKN2BAS基因rs1333049位点、rs4977574位点的等位基因频率和基因型频率进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示川崎病发病及合并CAL不受CDKN2BAS基因rs1333049位点、rs4977574位点的多态性影响。