临沂市鸭血制品动物源性成分检测及掺假分析

李 杰 钱云开 王 伟 申应德 姜 庆 张文萌 王建昌

1.临沂市检验检测中心 山东临沂 276000 2.秦皇岛海关技术中心 河北秦皇岛 066004 3.石家庄海关技术中心 河北石家庄 050000

动物血制品是中国饮食文化中常见的食材，口感细腻、味道鲜美的鸭血便是其中之一[1]。

鸭血仅占鸭重量的4%左右，蛋白质、氨基酸含量较高，同时含有多种生物活性物质，因此鸭血具有很高的营养价值[2，3]。

鸭血还可以被制作成鸭血豆腐，是火锅、麻辣烫的重要食材[4]。

鸭血作为名小吃“鸭血粉丝汤”的原料而供不应求。由于鸭血含量较低，加之需求巨大，因此鸭血的价格相对于牛血、鹅血等明显偏高[5]，由于动物血液在外观和色泽上基本相似，普通消费者很难将鸭血和其他血液区分，部分不法商贩便在鸭血中掺入其他物种的血液，甚至直接用其他物种的血液冒充鸭血[6]。

2012年，媒体曝光了北京“第五肉联厂”和“稻香村”等知名企业利用猪血冒充鸭血进行加工出售；2015年，媒体报道了“呷哺呷哺”、“小肥羊”等知名企业利用猪血冒充鸭血进行加工出售[7]。

2021年，济南市市场监管局会同公安机关，根据举报线索对生产“假鸭血”的“黑窝点”及使用“假鸭血”的餐饮单位联合开展执法检查。经查证位于济南市槐荫区的一家“黑窝点”使用鸡血冒充鸭血，加工成“假鸭血”，销往火锅店、川菜馆[8]。

随着分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应已成为检测肉类掺假最常用的方法之一。以DNA分子特异基因扩增技术为基础的实时荧光PCR(Real-Time PCR)技术具有简单、快速、灵敏度高和准确性高的优点，目前已是肉制品物种源性成分鉴定普遍采用的方法[9]。

本研究利用普通PCR和荧光定量PCR方法，参考国家标准、行业标准和自行设计的引物和探针对临沂市市售的53批鸭血制品进行动物源性成分分析，判断样品是否掺假，为居民食用鸭血制品提供指导意见，也为监管部门的风险监控提供理论数据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

鸭血及其制品，鸡肉、猪肉、鹅肉、牛肉、狗肉、兔子肉、驴肉，购于临沂市各大超市和商场；狐狸肉，貂肉，购于临沂市某屠宰场；火鸡肉、鸵鸟肉，购于京东商城。

1.1.2 试剂

DNA提取试剂，QIAamp Fast DNA Tissue Kit组织基因组DNA提取试剂盒；

荧光PCR试剂，宝生物 Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，宝生物猪源性成分实时荧光PCR检测试剂盒；

普通PCR试剂，宝生物 Premix TaqTM；

qPCR引物和探针合成，上海生工生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

荧光定量PCR仪，LightCycler96，瑞士罗氏；

定性PCR仪，C1000 Touch，美国伯乐；

凝胶成像仪，GelDoc XR+，美国伯乐；

水平电泳系统，PowerPac Universal Mini-Sub-Cell GT，美国伯乐；

超微量分光光度计，ND2000，美国Thermo；

微量管离心机，MIKRO 200R，德国Hettich。

1.3 实验方法

1.3.1 样品DNA的提取

用无菌剪刀取样品25mg，捣碎成肉糜，置于DNA提取试剂盒提供的管中，按照DNA提取试剂盒的步骤进行操作。

1.3.2 引物和探针

通过GenBank下载鸵鸟、鸡、鸭、鹅、火鸡、猪、牛、羊、驴、狗、狐狸、兔子、貂、水貂的cytb基因序列，利用clustalx软件对上述物种cytb基因序列进行比对，找出序列差异处，通过NCBI网站的引物设计工具Primer-BLAST和探针设计软件Primer Express 3.0设计一组鸵鸟特异性引物和探针，如表1所示。

猪源性成分试验由于采用了试剂盒法，引物和探针在标准中未能体现，其他物种源性成分试验所用的引物和探针如表1中采用的标准所示。

表1 引物、探针及标准Table 1 Information of primer, probe and standard

续表1

1.3.3 源性成分试验

鸵鸟源性成分试验的PCR反应体系和反应条件如下。

荧光PCR反应体系：10μL Premix Ex TaqTM，上下游引物、TaqMan探针各0.4μL(浓度为10μM)，提取DNA模板1μL，用灭菌水补足至总体积20μL。

PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃、15s，60℃、30s，40个循环。

其他物种源性成分试验涉及的PCR反应体系和反应条件按照表1中标准要求的方法进行试验。

1.3.4 鸵鸟成分特异性试验

利用超微量分光光度计测定样品DNA在260nm和280nm处的吸光值A260和A280。当A260/A280比值在1.7～1.9之间，适宜于PCR扩增。利用1.3.3中鸵鸟源性成分试验的PCR反应体系和反应条件，分别以鸵鸟、鸡、鸭、鹅、火鸡、猪、牛、羊、驴、狗、狐狸、兔子、貂、水貂动物的DNA为模板，利用超微量分光光度计测定上述样品DNA浓度，将DNA浓度稀释成1ng/μL,以纯水为模板作为空白对照，进行实时荧光PCR，验证引物的特异性。并对样品的扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI中进行比对。

2 结果与分析

2.1 鸵鸟成分特异性试验结果

检测结果显示，只有鸵鸟样品出现阳性扩增曲线，其他样品均无信号检出，空白对照也无信号检出。将鸵鸟阳性样本扩增产物的测序序列在NCBI进行BLAST比对，样本序列与鸵鸟cytb基因序列相似度大于99%。说明鸵鸟源性成分的引物和探针有良好的特异性。

2.2 源性成分试验结果

鸵鸟源性成分试验中，当Ct值≤35时，判定样品中含有鸵鸟源性成分，当Ct值≥40时，判定样品中不含鸵鸟源性成分，当35

其他物种的源性成分的结果分析参照表1中所列的标准作为判定标准。

结果显示，53批样品中,所有检品均能检出鸭源性成分，样品43号检出鹅源性成分，Ct值为28.76；样品16号检出牛源性成分，Ct值为32.55；其他源性成分均未检出。鹅、牛源性成分检测扩增曲线如图1、图2所示。

注：1-阳性对照；2-43号样品；3-阴性对照；4-空白对照图1 鹅源性成分检测Fig.1 Detection ofgoose-derived ingredients

注：1-阳性对照；2-16号样品；3-阴性对照；4-空白对照图2 牛源性成分检测Fig. 2 Detection of cow-derived ingredients

3 结论与讨论

近年来，我国畜牧业产业蒸蒸日上，肉牛养殖业的养殖规模也在不断扩大[10]。但是作为副产物的牛血，却在我国食品工业上应用还不多，牛血不能够被充分利用[11]。肉鹅养殖业也在我国各地蓬勃发展，目前我国是世界第一的养鹅大国，鹅血资源丰富。但是，目前肉鹅养殖的主要方向是鹅肉、鹅肝、鹅绒、鹅蛋，鹅血的利用却微乎其微[12，13]。许多不法商贩利用养殖业中产生的过剩的牛血和鹅血，对鸭血制品进行冒充或掺假，从中获利。

2018年南京市食品药品监督检验局对南京市场中鸭血制品进行检测，发现在33批鸭血制品中，20批出现掺假问题，其中3批检测结果为鹅血[14]。广西质量监督导报于2008年，报道了北京市场上，火锅店里出售的散装鸭血，基本上全部有假(都是用猪血、牛血制成的)。2017年3月有媒体曝光了哈尔滨一家鸭血加工厂用牛血兑水冒充鸭血，其产品直供包贝尔所开辣庄火锅。可以看出用鹅血和牛血冒充鸭血的现象时有发生。

本研究通过现行行业标准，国家标准以及自行设计的引物和探针，利用普通PCR和荧光定量PCR方法检测临沂市售53批鸭血制品的鸭、鸡、猪、鹅、牛、火鸡、鸵鸟、狐狸、狗、兔子、貂、水貂、驴源性成分，结果显示所有检品均能检出鸭源性成分，1批检出鹅源性成分，1批检出牛源性成分，掺假检出率为3.77%。检测结果说明存在鸭血中掺入鹅血和牛血的欺骗消费者的行为，但是总体掺假率较低。

本研究建立了一种可以快速检测鸵鸟源性成分的实时荧光PCR法，特异性强，反应时间短，反应时间约为1h，大大节约了时间成本，为动物源性成分检测提供有效技术手段。本研究为加强鸭血制品的监管力度，为监管部门的风险监控提供理论数据，也为居民食用鸭血制品提供指导意见，对打击鸭血掺假行为，保护消费者的合法权益提供了有效的技术支撑。