牛至提取物和枯草芽孢杆菌体外抑菌效果评价

辛 娜，邓露芳*，郭 亮*，宗文丽，班文杰，黄玉海

（1.北京三元种业科技股份有限公司饲料分公司，北京 101105；2.北京首农畜牧发展有限公司，北京 100076）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,BS）具有耐高温高压、耐酸碱、耐胆盐等抗逆性，是一种理想的微生物饲料添加剂。其作用机理是可消耗肠道内的氧气，促进肠道有益菌生长、拮抗有害菌的生长，维持肠道环境的稳态，同时可产生多种代谢产物，在动物养殖上应用可提高动物生长性能，改善肠道菌群结构，增强免疫力，同时具有净化养殖环境的功效[1-3]。牛至是一种多年生灌木或草本植物，属唇形科牛至属。牛至主要成分取决于产地和其他因素，主要分为挥发性和非挥发性两类成分，有效成分为香芹酚、百里香酚、迷迭香酸等。牛至提取物（Oregano extract，OE）具有提高动物采食量、抗菌、抗炎、抗氧化等功能[4-5]。目前，国内尚缺乏牛至提取物、枯草芽孢杆菌的国家标准，且生产厂家众多，生产工艺及产品品质、使用效果等方面也都存在差异。本试验选取6个不同厂家生产的牛至提取物和枯草芽孢杆菌产品，采用牛津杯体外抑菌方法，研究牛至提取物、枯草芽孢杆菌及其组合的抑菌效果，为筛选出较优的抑菌产品及组合提供基础数据。

1 材 料

1.1 指示菌株

大肠埃希氏菌（ATCC25922）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028），购于广东环凯生物科技有限公司。产气荚膜梭菌毒素A 型（BNCC125404）,购于北纳创联生物科技有限公司。

1.2 牛至提取物（OE）和枯草芽孢杆菌（BS）

6个不同厂家生产的牛至提取物（OE）和枯草芽孢杆菌（BS），均为市售产品，由北京三元种业科技股份有限公司饲料分公司收集。6个牛至提取物和枯草芽孢杆菌分别标记为OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5、OE-6 及BS-1、BS-2、BS-3、BS-4、BS-5、BS-6。

1.3 培养基

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，购自北京陆桥技术股份有限公司。

2 方 法

2.1 不同牛至提取物和枯草芽孢杆菌产品对致病菌的抑制试验

参照刘冬梅等[6]研究中的牛津杯扩散法进行试验。取灭菌营养琼脂培养基，待温度降至50 ℃左右时倒平板，每个平皿约15 mL。待琼脂凝固后用灭菌的镊子夹牛津杯置于营养琼脂平板中。每个平板放置4个牛津杯。分别取大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌0.1 mL（108cfu·mL-1）加入到已灭菌的100 mL 营养琼脂中（冷却至50 ℃左右），摇匀后倾倒，注意不要起泡。待琼脂凝固后，用镊子将牛津杯夹出来（牛津杯外径8 mm），分别标记为孔1、孔2、孔3、孔4。枯草芽孢杆菌用纯化水稀释，牛至提取物用无水乙醇稀释备用。孔1中加入相对应的稀释液100 μL作对照，取不同厂家的牛至提取物和枯草芽孢杆菌稀释液100 μL加入孔2、孔3、孔4 中，3 个重复。置于4 ℃冰箱中放置1 h 后，37 ℃培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。

2.2 牛至提取物和枯草芽孢杆菌不同配比对致病菌的抑制试验

根据抑菌试验结果，筛选出抑菌效果好的牛至提取物和枯草芽孢杆菌产品各4个，然后进行两两联合抑菌试验。具体试验方法同2.1。

3 结果与分析

3.1 不同厂家牛至提取物体外抑菌试验

不同厂家牛至提取物对致病菌的抑制作用效果见表1。从表1 可知，所有厂家生产的牛至提取物均对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌及产气荚膜梭菌具有抑制作用，不同产品体外抑菌效果不同。OE-5 对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直径分别是14.51 mm、13.08 mm；OE-2 对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径为15.80 mm，抑菌效果最好。综上，体外抑菌效果较好的3个产品分别是OE-2、OE-4、OE-5，其次是OE-6 和OE-1，OE-3体外抑菌效果最差。

表1 不同厂家牛至提取物对致病菌的抑制作用

3.2 不同厂家枯草芽孢杆菌的体外抑菌试验

不同厂家枯草芽孢杆菌对致病菌的抑制作用效果见表2。

表2数据显示，不同厂家的枯草芽孢杆菌对致病菌的抑制作用不同，其中，BS-1和BS-5对大肠埃希氏菌具有抑制作用，BS-1 抑菌性优于BS-5；BS-1、BS-4 和BS-6 对产气荚膜梭菌有抑制作用，抑菌强弱顺序依次为BS-1>BS-6>BS-4；所有产品对鼠伤寒沙门氏菌均没有抑制作用。综上，体外抑菌效果较好的4个产品分别是BS-1、BS-4、BS-5、BS-6。

表2 不同厂家枯草芽孢杆菌对致病菌的抑制作用

2.3 牛至提取物和枯草芽孢杆菌组合抑菌作用

牛至提取物和枯草芽孢杆菌组合抑菌作用见表3。

表3 续

表3 牛至提取物和枯草芽孢杆菌组合对致病菌的抑制作用

由表3可知，牛至提取物和枯草芽孢杆菌组合对致病菌的抑制作用效果不同，OE-2与BS-5复配对大肠埃希氏菌抑菌效果较好，抑菌圈直径为11.74 mm；OE-2与BS-6复配对鼠伤寒沙门氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直径为10.45 mm；OE-2 与BS-4 对产气荚膜梭菌的体外抑菌效果最好，抑菌圈直径为12.01 mm。

4 讨 论

随着抗生素的禁用，微生态制剂和植物提取物成为研究的焦点。众多学者研究证实，枯草芽孢杆菌对致病菌具有一定的抑制作用。张亚茹等[7]研究证实，枯草芽孢杆菌菌株N2-10对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出黏附抑制作用，尤其是金黄色葡萄球菌，菌株细胞表面疏水性可达31.9%。本试验条件下，不同厂家枯草芽孢杆菌抑菌作用不同，仅个别厂家枯草芽孢杆菌对大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌表现出一定的抑制作用。枯草芽孢杆菌抑菌主要是通过产生代谢产物以及与致病菌竞争营养空间两个途径来实现对病原菌的抑制作用。枯草芽孢杆菌代谢产生的细菌素对致病菌L.monocytogens（ATCC19114）及M.luleus2016表现出较强的杀菌及抑菌活性[8]。翟召静[9]提取枯草芽孢杆菌的代谢物，经蛋白质组学分析发现在10 个差异上调蛋白中，大部分有降解RNA、抑制蛋白质表达的功能，特别是mRNA干扰酶，可引起细胞凋亡。

牛至油、香芹酚、百里香酚对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌具有显著体外抑菌作用[10]。李定刚等[11]研究证实，不同工艺来源的牛至提取物都能在一定程度上降低大肠杆菌所致十二指肠肠道损伤，改善小鼠肠道组织结构。本试验条件下，牛至提取物对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌均表现出较好的抑菌效果。牛至提取物所含酚类、萜类、非挥发性物质均具有一定的抑菌作用。酚类物质抗微生物的原理是作用于细菌的细胞膜，使细菌细胞膜的蛋白质变性，改变细胞膜的通透性，或与细胞膜中的磷脂反应，破坏蛋白质的合成，使微生物细胞的生长受抑制。萜类物质能影响细菌中DNA 的自我复制过程，从而抑制细菌的繁殖和生长过程，进而抑制菌体的生长[12]。牛至非挥发性物质对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌具有较好的抗菌活性[13]。目前未见牛至提取物和枯草芽孢杆菌联合抑菌的报道，但是从联合试验结果也可以看出，OE-2 和BS-5 对大肠埃希氏菌、OE-2 和BS-6 对鼠伤寒沙门氏菌、OE-2 和BS-4对产气荚膜梭菌均具有较好的体外抑菌效果。

抑菌试验的影响因素众多，试验方法[14]、试验条件[15]、质控菌株[16]等因素都会影响抑菌试验的结果及敏感性，本试验控制在同一试验条件下，研究对同一株质控菌株的影响，不同厂家的产品抑菌结果存在差异的原因主要由产品的生产工艺、主成分及含量的差异等因素造成。

5 结 论

体外抑菌结果表明，牛至提取物和枯草芽孢杆菌均表现出一定的体外抑菌效果。OE-5，BS-1体外抑菌效果最好。联合抑菌试验中OE-2和BS-5对大肠埃希氏菌、OE-2 和BS-6 对鼠伤寒沙门氏菌、0E-2和BS-4对产气荚膜梭菌也表现出一定的抑菌效果，可进一步研究其在饲料配方及动物试验中的应用效果。