布劳恩脂蛋白对大肠埃希氏菌感染导致的小鼠体内细胞因子分泌及死亡的调节作用

巩志国，顾柏臣，沈 媛，李茜如，金 凤，赵佳敏，刘 博

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)是一种常见的革兰氏阴性菌，普通菌无致病性[1]。但致病性大肠埃希氏菌可导致多种感染性疾病，如尿路感染、血液感染和脓毒症[2]。大肠埃希氏菌感染导致的疾病可分为肠道疾病和肠道外疾病[3]。在大肠埃希氏菌感染宿主过程中，炎症反应强度与细胞因子分泌具有密切关联[4]。这一过程始于病原体相关分子模式被宿主天然免疫系统的模式识别受体，进而诱导细胞因子和趋化因子等炎性介质的表达[5]。脂多糖(LPS)存在于革兰氏阴性菌外膜中，是诱导宿主天然免疫应答激活的有效激动剂。LPS被Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)识别，激活转录因子NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶信号通路，进而介导促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，最终激活免疫细胞[6]。

除LPS外，布劳恩脂蛋白(BLP)亦是大肠埃希氏菌外膜成分之一，是一种具有免疫活性的细菌脂蛋白，可通过TLR2的识别激活，在宿主体内诱导一种类似于LPS的内毒素反应[7]。表明大肠埃希氏菌感染的内毒素反应不仅与LPS有关，还依赖于BLP的存在。人工合成细菌脂蛋白Pam3CSK4可激活单核细胞和巨噬细胞产生炎性细胞因子，并在C3H/HEN和C3H/HEJ小鼠中引起致死性休克。此外，人工合成细菌脂蛋白Pam3CSK4除可作为TLR2的激动剂诱导宿主炎症反应外，其介导的耐受现象也可发挥一定的保护效应，使小鼠免受LPS、活细菌和脓毒症导致的死亡。本文分析了BLP对大肠埃希氏菌感染后小鼠体内细胞因子分泌、脏器损伤和小鼠死亡情况，为阐明BLP在调控大肠埃希氏菌感染导致的宿主炎症反应中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂、药品和抗体 PBS缓冲液，Hyclone公司产品；LB肉汤培养基，Oxoid公司产品；T-PER组织裂解液和BCA蛋白定量试剂盒，Thermo Scientific公司产品；小鼠TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒，Biolegend公司产品；小鼠IL-10 ELISA试剂盒，Bioscience公司产品；小鼠RANTES试剂盒，Peprotech公司产品；兔抗HMGB1多克隆抗体，Novus Biologicals公司产品；兔抗HABP2单克隆抗体和Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG二抗，Abcam公司产品。

1.1.2 实验动物 C57BL/6J健康小鼠，8周龄～10周龄，体重约22 g，购自南京大学模型动物研究所。

1.1.3 仪器设备 多功能酶标仪，Bio-Tek公司产品；低温高速离心机，Thermo Fisher公司产品；组织匀浆仪，杰灵仪器制造有限公司产品；激光共聚焦显微镜，Zeiss公司产品；冰冻切片机，SLEE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 野生型大肠埃希氏菌(鉴定证书号SYS110017，BLP表达阳性)由本课题组分离鉴定并保存[8]。大肠埃希氏菌JE5505(BLP表达阴性，CGSC #6672)从美国耶鲁大学大肠埃希氏菌基因储存中心获得。2株大肠埃希氏菌生长性状一致，且可互相作为感染对照菌株加以应用[9]。在-80℃低温保存的菌液在4℃环境中融化后，转移至100 mL已灭菌的LB肉汤培养基中，于37℃、200 r/min恒温摇床中连续培养12 h。用酶标仪检测菌液OD600nm值大约为0.9时，表明其处于对数生长期。将菌液混匀后取1 mL到无菌无酶离心管中，3 000 r/min离心6 min，弃上清，用无菌PBS溶液重悬菌液3次，最后用1 mL PBS缓冲液重悬细菌，4℃保存备用。

1.2.2 试验处理 1×108C57BL/6J小鼠腹腔注射1×108CFU野生型大肠埃希氏菌，1×108CFU大肠埃希氏菌JE5505或1×108CFU大肠埃希氏菌JE5505与BLP(10 mg/kg)联合刺激作为处理组，腹腔注射等体积PBS作为未感染对照组。观察小鼠存活情况，每组20只小鼠。注射后3 h和6 h后采血，用离心管收集血液，倾斜放置在室温环境中2 h后转移至4℃冰箱中过夜。1 500 r/min离心5 min取上层血清，置于-80℃备用。分别收集感染3 h，6 h和12 h后小鼠的肝脏及肺脏，将收集的新鲜脏器迅速置于液氮中保存备用。

1.2.3 促炎性细胞因子和趋化因子的表达 将在-80℃低温保存的血清、肝脏和肺脏置于4℃环境下缓慢解冻，称取0.04 g肺脏和肝脏于研磨管中，加入T-PER组织裂解液300 μL。随后置于组织研磨仪进行研磨，重复研磨2次，1 500 r/min离心20 min，收集上清液重复离心1次，使用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度，将处理好的肝脏和肺脏上清样品液稀释同样浓度。按照ELISA试剂盒说明书检测血清、肝脏和肺脏中TNF-α、IL-1β、RANTES和IL-10的分泌水平。

1.2.4 肝脏和肺脏损伤标记物HMGB1和HABP2蛋白的表达 将在-80℃低温保存的肝脏和肺脏移至4℃环境下缓慢解冻，取小块组织使用包埋剂将其包埋处理后，用冰冻切片机切成6 μm厚的切片，随后用冷丙酮固定10 min。固定完成后的切片在含2.5 mL/L吐温的冷PBS中清洗3次，每次10 min。随后室温下用含有50 mL/L牛血清白蛋白的封闭液孵育1 h。加入兔抗HMGB1多克隆抗体或兔抗HABP2单克隆抗体，在4℃避光条件中孵育过夜。孵育完成后，用含2.5 mL/L吐温的PBS洗涤3次，每次15 min，然后用Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG二抗在室温条件下避光孵育1 h。用共聚焦显微镜进行图像采集(100倍)，并进行荧光强度分析。

1.2.5 统计分析 用GraphPad Prism 8软件统计并进行差异性分析(3次重复试验数据Mean±SD，One-Way ANOVA)，以P<0.05视为差异显著(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

2 结果

2.1 BLP对大肠埃希氏菌感染导致小鼠死亡的影响

用野生型大肠埃希氏菌(1×108CFU)、大肠埃希氏菌JE5505(1×108CFU)和JE5505(1×108CFU)与BLP(10 mg/kg)联合感染刺激后进行小鼠死亡情况的分析。结果表明(图1)，在感染28 h后，野生型大肠埃希氏菌感染试验组小鼠存活率为85%，而大肠埃希氏菌JE5505感染试验组小鼠全部死亡。在感染40 h后，野生型大肠埃希氏菌感染试验组小鼠方出现全部死亡的现象。JE5505与BLP联合组刺激小鼠20 h后小鼠不在出现死亡上述结果表明，BLP对大肠埃希氏菌感染导致的小鼠死亡具有一定的保护作用，可在一定程度上避免小鼠出现由感染导致的快速死亡。

图1 大肠埃希氏菌感染后小鼠的死亡情况Fig.1 Mortality of mice infected with E.coli

2.2 BLP对大肠埃希氏菌感染后小鼠肝脏、肺脏和血清中细胞因子分泌水平的影响

用野生型大肠埃希氏菌(1×108CFU)、大肠埃希氏菌JE5505(1×108CFU)和JE5505(1×108CFU)与BLP(10 mg/kg)联合感染刺激后分析小鼠肝脏、肺脏和血清中促炎性细胞因子(TNF-α和IL-1β)、抗炎因子(IL-10)和趋化因子(RANTES)的分泌水平。结果表明(图2)，与未感染对照组相比，使用野生型大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌JE5505或JE5505与BLP联合感染刺激3 h和6 h后，小鼠肝脏、肺脏和血清中TNF-α、IL-1β、IL-10和RANTES分泌水平均出现显著上升(P<0.01)。感染3 h或6 h后，与野生型大肠埃希氏菌感染组和JE5505与BLP联合感染刺激组小鼠相比，大肠埃希氏菌JE5505感染组小鼠肝脏、肺脏或血清中TNF-α、IL-1β和RANTES处于较高水平，而IL-10处于较低水平。表明BLP对大肠埃希氏菌感染后小鼠肝脏、肺脏和血清中促炎性细胞因子和趋化因子的分泌水平具有下调作用，而对抗炎因子的分泌水平具有上调作用。

图2 大肠埃希氏菌感染后小鼠肝脏、肺脏和血清中细胞因子的分泌水平Fig.2 Secretion of cytokines in liver,lungs and serum of mice infected with E.coli

2.3 BLP对大肠埃希氏菌感染后小鼠肝脏和肺脏组织损伤的影响

用野生型大肠埃希氏菌(1×108CFU)和大肠埃希氏菌JE5505(1×108CFU)和JE5505(1×108CFU)与BLP(10 mg/kg)联合感染刺激12 h后分析小鼠肺脏和肝脏中组织损伤标志物HABP2和HMGB1的表达情况。结果表明(图3)，与未感染对照组相比，野生型大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌JE5505或JE5505与BLP联合感染刺激后，小鼠肝脏和肺脏中HABP2和HMGB1的表达均显著上升(P<0.001)。与野生型大肠埃希氏菌组和JE5505与BLP联合感染刺激小鼠相比，大肠埃希氏菌JE5505感染组小鼠肝脏或肺脏中HABP2和HMGB1的表达显著处于较高水平。表明BLP对大肠埃希氏菌引起的小鼠脏器中组织损伤标志物HMGB1和HABP2的蛋白表达具有下调作用。

图3 大肠埃希氏菌感染后小鼠肝脏和肺脏中组织损伤标志物HABP2和HMGB1的表达情况Fig.3 Expression of tissue damage markers HABP2 and HMGB1 in liver and lungs of mice infected with E.coli

3 讨论

细菌感染可引起全身性炎症反应，导致宿主脓毒症或感染性休克[10]。大肠埃希氏菌LPS是一种细菌内毒素，是造成宿主感染后发生脓毒症的主要原因之一，但LPS并不是大肠埃希氏菌唯一诱导宿主产生炎症反应的免疫生物活性成分。细菌脂蛋白也可使宿主产生炎症反应。在大肠埃希氏菌菌体成分中，BLP是一种可以诱导TLR2激活的细菌外膜成分，且与大肠埃希氏菌引起的宿主体内细胞因子分泌和内毒素休克具有紧密关系[7]。本研究结果表明，BLP对大肠埃希氏菌感染导致的小鼠体内细胞因子分泌、脏器损伤和随后发生的小鼠死亡均具有体一定的调控作用。

与野生型大肠埃希氏菌(BLP表达阳性)相比，缺乏免疫生物活性成分BLP的大肠埃希氏菌JE5505在感染小鼠后，造成宿主死亡更迅速。BLP在大肠埃希氏菌感染引起的宿主死亡中发挥了一定的作用(图1)，可能是通过宿主对细菌脂蛋白形成的耐受实现的。细菌感染导致宿主死亡的主要原因是严重的全身性炎症反应，而细胞因子和趋化因子的分泌是炎症反应强度的关键指标[4,11]。大肠埃希氏菌感染可引起宿主体内促炎性细胞因子包括TNF-α和IL-1β的分泌，进而介导局部和全身性炎症反应，以及脏器损伤过程。IL-10作为一种抗炎因子在细菌感染和宿主炎症反应中，对组织内稳态的维持发挥了重要作用[12]。本研究分析了BLP对大肠埃希氏菌感染后小鼠体内促炎细胞因子、抗炎细胞因子和趋化因子的分泌，以及脏器组织损伤标志物的表达是否具有调控作用。

结果表明，BLP的存在对大肠埃希氏菌感染后小鼠血清、肺脏和肝脏中的促炎细胞因子(TNF-α和IL-1β)和趋化因子(RANTES)的分泌水平均有下调作用，而对抗炎细胞因子(IL-10)的分泌水平有上调作用(图2)。BLP对大肠埃希氏菌感染引起的小鼠肝脏和肺脏中HABP2和HMGB1表达有下调作用。说明在大肠埃希氏菌感染过程中，BLP可能通过下调宿主的全身炎症反应，对脏器损伤产生一定保护作用，从而避免由细菌感染导致的宿主快速死亡。

在细菌感染过程中宿主对细菌脂蛋白的耐受可能是一种重要的病原-宿主调节机制。如人工合成细菌脂蛋白Pam3CSK4可以诱导宿主免疫细胞形成对脂多糖的交叉耐受，从而下调人单核细胞TNF-α的分泌。人工合成细菌脂蛋白Pam3CSK4可诱导宿主对感染性休克的耐受，并保护小鼠免受LPS引起的致死现象。BLP可能在大肠埃希氏菌感染过程中诱导宿主形成耐受现象，进而通过对细胞因子和趋化因子分泌的调控，对小鼠脏器损伤和死亡产生保护作用。该现象可能是病原微生物与宿主之间形成的一种共生平衡，通过延长宿主的生存时间，进而为大肠埃希氏菌在宿主体内的繁殖创造更有利的条件，该现象的具体机制有待进一步研究。